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领沙坦对肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad3， Smad7表达的影晌

　　肝纤维化是肝脏对慢性损伤的-种修复反应，也是各种慢性肝病发展到肝硬化乃至门脉高压的必经阶段和病理基础。因此，探讨肝纤维化的防治方法，阻断肝纤维化的进程，是防止肝纤维化进展为肝硬化的关键，具有重要的临床意义。缴沙坦作为血管紧张素ITI型受体拮抗剂(ARB)，能选择性的阻断血管紧张素IT(AngIT)与AT!受体的结合，产生明显的降压作用，因此临床上主要用于高血压的治疗，与此同时，绩沙坦的抗纤维化作用也在大量的实验研究中逐步显现。而作为肝纤维化特异性指标的转化生长因子自(TGF-β1)，通过细胞内Smad信号通道蛋白使肝星状细胞(HSC)激活、增生，产生大量细胞外基质(ECM)沉积于Disse间隙，发挥促纤维化的作用。因此，给予缴沙坦干预观察大鼠TGF-β1/Smad3， Smad7的表达，能进一步验证该药物是否具有抗肝纤维化作用。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　成年雄性Wistar大鼠60只，体质量l80-220g，由山西医科大学实验动物中心提供。四氯化碳(CC14)由天津化学试剂厂生产，绷沙坦为北京诺华制药有限公司产品。Z-LX800酶标仪、ELXSO洗板机由山西医科大学消化内科实验中心提供。

　　1.2实验方法

　　1.2.1动物模型的制备

　　大鼠采用复合因素法制作肝纤维化模型，以单纯玉米面作为饲料(前两周为79.S%玉米面，20%猪油)，并混入0.5%胆固醇， 10%酒精为唯-饮料，首次按O.S此ilOOg体质量背部皮下注射纯CC14，以后每隔3日按0.3mL/100g体质量注射40%CC14，共8周。

　　1.2.2实验分组

　　随机选12只大鼠作为正常对照组(普通饮食)，成模过程中分别于制模的2、4、6、8周随机处死大鼠作为不同阶段模型组，每组6只，将8周后成模大鼠再随机取6只作为8周末模型对照组，予等量生理盐水灌胃，其余成模大鼠予以缀沙坦(20mg/Kg， 1次/日，共2周)灌胃，正常对照组予以等量生理盐水灌胃， 2周后处死各组大鼠。造模过程中大鼠死亡8只。

　　1.2.3标本采集

　　大鼠禁食l2h，不禁饮水，以40%乌拉坦(Smg/kg腹腔内注射)麻醉，经腹主动脉采血SmL，离心后收集上清液保存于4°C冰箱中备用，同时取大鼠肝右叶组织10g，经10%甲醛固定，石蜡包埋备用。

　　1.2.4肝纤维化指标的检测

　　ELISA法检测大鼠血清中TGF-β1的表达，将肝组织切片，采用免 疫组化法(S-P法)检测肝组织中Smad3及Smad7的表达。抗体购自美国Santa Cruza公司， PBS液代替-抗作为阴性对照。阳性表达呈棕色，阴性呈蓝色。采用HPlAS2000型图像分析软件进行定量分析，随机选取每张切片5个视野(x物。倍)测定阳性细胞的吸光度(A值)及面积，以二者乘积表示组织中该抗原相对含量，乘积越大表示抗原含量越高。1.2.S组织病理学观察

　　肝组织行HE染色和Masson染色，光镜下观察肝组织病理改变。

　　1.2.6统计学分析

　　计量资料用均数±标准差(王土s)表示，采用SPSS13.0统计分析软件包进行单因素方差分析，组间比较采用LSD法，双侧α=0.05为显著性检验水准。

　　2结果

　　2.1实验不同阶段大鼠肝纤维化指标的表达情况

　　肝纤维化不同阶段大鼠血清中TGF- β1以及肝组织Smad3、Smad7的表达，见表I，绷沙坦干预后大鼠血清中TGF-β1及肝组织Smad3、Smad7的表达，见表2。

　　2.2肝组织病理变化

　　经HE染色和Masson染色，光镜下可见正常对照组肝小叶结构正常，肝细胞索排列规则，模型组随着造模时间的延长，肝小叶结构逐渐被破坏，被广泛增生的纤维组织分割成大小不等的圆形或类圆形肝细胞团，形成假小叶，假小叶内的细胞排列不规则，纤维间隔内有炎症细胞浸润。部分肝细胞坏死后无序排列，部分肝细胞内含有脂滴，其数量随着造模时间的延长而增加。造模的第6、8周末，可见中央静脉常缺如、偏位或两个以上。绷沙坦治疗组大鼠的肝细胞坏死面积减少，可见少量再生的肝细胞，纤维组织增生减少，其内的炎症细胞减少，肝小叶结构有所恢复。

　　3讨论

　　肝纤维化是指肝脏内纤维结缔组织异常增生，是肝脏对损伤的一种慢性修复过程。其病理特征是胶原纤维生成及大量细胞外基质(ECM)在Disse间隙沉积。研究表明ECM的合成与降解过程受转化生长因子(TGFβ)调控。哺乳动物TGF-β共有三种TGF-βl、TGF-β 2和TGF- β3其中肝脏含量最高且具有生物活性的 是TGF-β1在TGF-βl的作用下，肝星状细胞(HSC)活化并转化为成纤维细胞，分泌产生大量间质胶原， HSC的激活、增生和转化被认为是肝纤维化的中心环节。而TGF- β1则被认为是肝纤维化最重要的始动因子之一[飞还有实验证明，抑制TGF- β1可以增加肝实质细胞再生，同时抑制肝纤维化的进程。大量研究证实， TGF- β /Smad信号转导通路是TGF-β发挥生物学作用的主要通路，通过细胞内Smad信号通道蛋白发挥促纤维化的作用。由此可以认为TGF信号通路上的关键分子是胞质蛋白Smadso Smad至少有8个成员， pSmadl斗，根据其功能分为3类z第1类膜受体激活Smad (R-Smad)，有Smad1 ，2， 3， 5， 8，第2类通用型Smad(00-Smad)，只有Smad 4，可与其他 Smad结合形成稳定的异源多聚体，转位入胞核调节靶基因转录g第3 类抑制性Smad(I- Smad)，有Smad6，7，其中Smad7可与R-Smad竞争性结合受体，阻止R-Smad磷酸化，或抑制Smad多聚体形成从而阻断TGF-βl的信号，进而抑制TGF-βl剌激HSC的I型胶原(Col- I)的表 达，最终抑制肝纤维化的进程g而Smad6主要负调控蛋白骨形态发生蛋白(BMP)和部分TG孔下的细胞内信号转导。同时该信号通路又存在广泛的交互影响，对不同的组织细胞及纤维化程度的影响均有明显的差异。本实验结果表明，随着造模时间的延长， TGF-β1及Smad3的表达进行性升高，而Smad7的含量则随着造模时间的延长进行性减键分子， R-Smad中的Smad3直接向细胞内传递信号，激活HSC，产生肝纤维化的结果。在此过程中， Smad3随着肝纤维化程度的加深以及TGF- β1表达的增加而增加。相反，作为负调节因子的Smad7则在肝纤 维化的发展进程中被抑制，这一结果又弱化了Smad7对肝纤维化的进展的抑制，导致肝纤维进一步加重。

　　大量研究己证实[9131，肾素-血管紧张素系统(队S)主要是通过循环中的血管紧张素II (Ang II)调节体液及电解质平衡、血压及血容量，他刺激醒固酣合成和分泌，直接收缩小动脉平滑肌使血压升高。而绩沙坦作为血管紧张素II I型受体拮抗剂(ARB)，能选择性的阻断AngII与AT!受体的结合，在受体水平完全阻断AngII的作用，抑制HSC活化，同时消除Ang II对TGF-β1正调控作用，使受损肝脏TGF- β1表达减少，抑制TGF- β1促进HSC活化、增殖及转化作用，减 少ECM的合成。另有研究发现，绩沙坦即可抑制胶原在肝脏沉积又可促进胶原降解，从而发挥其抗肝纤维化作用。本实验发现，于造模第8周末给予缴沙坦干预2周后， TGF- β1的表达水平及Smad3的表达明 显减少，而Smad7的含量明显增加。组织病理学观察发现，随着造模时间的延长，肝小叶结构逐渐被破坏，假小叶逐渐形成，纤维间隔内有炎性细胞浸润，部分肝细胞坏死后无序排列，坏死面积随着造模时间的延长增大。缴沙坦治疗2周后，肝脏纤维组织增生减少，其内的炎症细胞减少，肝细胞坏死面积缩小，可见少量再生的肝细胞。该结果说明缅沙坦具有减轻肝组织损伤和炎症反应，减少胶原物质在细胞外沉积的作用，其机制可能与降低TGF-β1 /Smad3以及增加Smad7的表达有关。

　　综上所述，缴沙坦在临床上不仅可以作为降压药物，用于治疗高血压，而且具有明显的抗肝纤维化作用。本实验结果为临床治疗肝纤维化提供了一种新的思路及理论依据。但缴沙坦的抗纤维化机制可能是多方面的，具体的作用机制以及是否具有同样的临床效果还有待进一步的观察论证。

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