本文是一篇专业的医学论文，主要对内源性NO在人宫颈癌Hela细胞株合成对顺铂敏感性的影响的介绍，详情请看下面的介绍。

 

　　目前一氧化氮（Nitric Oxide,NO）对调节肿瘤细胞化疗敏感性的研究已取得一定进展 。有实验[2]表明，恶性肿瘤组织缺氧所致的NO的合成减少与肿瘤细胞耐药之间有着密切的关系，在发展迅速的肿瘤组织中给予一定量外源性促NO释放的药物后可使肿瘤细胞化疗后的生存率大为下降。顺铂（Cisplatin，DDP）是宫颈癌化疗中的经典药物，较其它化疗药物疗效显着[3]。实验通过观察人宫颈癌Hela细胞在细胞因子γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）的诱导下内源性NO的产生情况，并进一步研究产生的NO是否可以提高Hela细胞对DDP敏感性以达到降低宫颈癌化疗耐药的目的。

 

　　1 材料与方法

 

　　1.1 材料

 

　　人宫颈癌Hela细胞株，DDP，重组人干扰素-γ（Recombinant Human Interferon-γ，IFN-γ），RPMI Medium 1640培养基，标准胎牛血清，一氧化氮测试盒（硝酸还原酶法），MTT细胞增殖-毒性检测试剂盒，NG-甲基-L-精氨酸（L-NMMA），L-精氨酸（L- arginine,L-Arg）。

 

　　1.2 实验方法

 

　　1.2.1 人宫颈癌Hela细胞培养。将Hela细胞置于5%的CO2培养箱中37 ℃恒温培养，培养液为PH7.2～7.4的RPMI 1640培养液，内含10％胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 U/mL。利用倒置显微镜下观察到细胞呈贴壁状态生长状态良好，用0.25%胰蛋白酶消化传代2～3次/周，当细胞呈对数生长期时用于后续的实验。

 

　　1.2.2 IFN-γ诱导人宫颈癌Hela细胞合成内源性NO。将Hela细胞按照1×106/mL密度接种于6孔培养板中，分别用含和不含1nM IFN-γ的培养液2 mL分别继续培养两组的Hela细胞。采用一氧化氮测试盒与紫外分光光度计在2 h、4 h、8 h、16 h、24 h后分别测定实验组与对照组培养液中NO的含量。再次将6孔培养板的Hela细胞中随机加入含不同浓度（10~13 M、10~12 M、10~11 M、10~10 M、10~9 M、10~8 M）的2 mL IFN-γ培养液，培养8 h。再次检测各孔细胞培养液中NO的含量。

 

　　1.2.3 MTT法测试经IFN-γ处理后的Hela细胞在不同浓度DDP下的生存率。将Hela细胞按照5×104/mL密度接种于96孔培养板中，100 μL/孔。随机将各孔分成实验组A（用IFN-γ处理）、实验组B（不用IFN-γ处理）、无处理因素的对照组C以及无细胞培养基的对照组D，分别向A组各小组（A组：A1、A2、A3、A4）中加入含有IFN-γ 1nM和不等浓度（0.5 μM、1 μM 、2 μM、4 μM）DDP的培养液100 μL，分别向B组各小组（B组：B1、B2、B3、B4）中加入含不等浓度（0.5 μM、1 μM 、2 μM 、4 μM）DDP的培养液100 μL。使用MTT法计算各实验组中Hela细胞的生存率。

 

　　1.2.4 经IFN-γ处理的Hela细胞加入L-Arg或L-NMMA后在DDP作用下生存率变化。按照5×104/mL的密度接种在96孔培养板中，100 μL/孔。将各孔分为实验组G、H、I、J组：G组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、0.5 mM L-NMMA和2 μM DDP；H组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、10 mM L-Arg 和2 μM DDP；I组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、0.5 mM L-NMMA、10mM L-Arg和2 μM DDP；J组每100 μL培养液含0.5 mM L-NMMA、10 mM L-Arg和2 μM DDP；利用MTT法算出各实验组Hela细胞的生存率。

 

　　1.2.5 统计方法 采用SPSS13.0统计学软件对所得的数据进行分析处理，两个独立的样本组间的均数比较用t检验，多组间的均数比较采用方差分析。

 

　　2 结果

 

　　2.1 实验组中的Hela细胞在加入IFN-γ作用4 hNO产量明显上升（97.328 μM），IFN-γ作用8 h后NO产量达到高峰（152.335 μM），其后随时间延长NO产量逐渐下降；而未加IFN-γ的对照组Hela细胞自始至终NO的产量无明显变化（P＜0.05）。见图1。经不同浓度的IFN-γ处理Hela细胞8 h后，NO的生成量在一定范围内随IFN-γ浓度升高而上升。见图2。

 

　　2.2 以MTT法分别检测实验组与对照组Hela细胞的生存率，当DDP浓度为0.5 μM和1 μM时，实验组Hela细胞的生存率明显低于对照组（P＜0.05），但高浓度的DDP作用下，两组的Hela细胞生存率比较差异无统计学意义。见图3。

 

　　2.3 加入IFN-γ和NO合成促进剂L-Arg组（H组）Hela细胞经DDP作用后的生存率明显下降（P＜0.05），而加入NOS的抑制剂L-NMMA组（G组）及未加IFN-γ组（J组）Hela细胞在DDP作用后的生存率较高。

 

　　3 讨论

 

　　在NOS作用下由精氨酸脱氨基可产生NO，因其性质不稳定而较容易通过弥散出入质膜直接进入相邻的细胞，在局部发挥作用。NOS至少有3种亚型：NOSI （nNOS，神经元型），NOSII （iNOS，炎性/免疫诱导型），NOSIII（eNOS，内皮细胞型），其中NOSII为诱导型（iNOS），NOSI、NOSIII为结构型（cNOS）[4]。在某些细胞因子如γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1（IL-1）等的诱导下，血管平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞、肝细胞或肿瘤细胞内产生iNOS[5]，而细胞内的精氨酸在iNOS的催化下通过脱氨基作用可持续产生大量的NO[6]。

 

　　研究结果表明，在加入IFN-γ的实验组中Hela细胞NO的产生量比不加IFN-γ的对照组显着增加，并且NO的生成量与IFN-γ的浓度与作用时间密切相关，由此可见在IFN-γ诱导下Hela细胞能够合成大量内源性的NO。当DDP浓度为0.5μM和1 μM时，实验组Hela细胞的生存率明显低于对照组（P＜0.05），但在高浓度DDP的作用下，两组的Hela细胞生存率差异无统计学意义（P＞0.05），说明在IFN-γ诱导下Hela细胞合成的内源性NO在一定程度上提高了细胞对DDP敏感性。通过加入iNOS抑制剂L-NMMA和NO的合成原料L-Arg来调整内源性NO的产量，得出结论：Hela细胞在DDP下的生存率在前者最高而后者降低，而导致结果不同的原因在于其生成的NO量不同，从而进一步证明了内源性NO具有调节Hela细胞对DDP敏感性的效应。

 

　　相似的研究表明 NO可增强许多化疗药物的化学敏感性。魏雪敏等[7]为了探讨NO对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响，选用人宫颈腺癌细胞株HeLa细胞和宫颈鳞癌细胞株Caski细胞，在培养基中加入不同浓度NO供体--硝普钠(SNP)后培养，证明了NO能抑制宫颈癌细胞的生长，促进其凋亡。在Muir等[8]的实验中，在低氧浓度下选用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，采用三维立体培养孵育细胞并用NO抑制剂处理细胞，然后检测抗肿瘤药物耐药性，结果显示在缺氧状态下肿瘤细胞的耐药性被NO抑制剂所加强，其机理可能为可提高肿瘤细胞化学敏感性内源性NO受到了抑制。相似的结论在Cook等人的实验中也得到体现[9]，将人乳腺癌细胞系MCF-7与可溶性NO释放药物孵育培养后加入美法仑，MCF-7细胞的生存率由未加NO释放剂时的55％降低到15％。

 

　　综上所述，无论是外源性还是内源性NO都已经成为了降低肿瘤细胞对化疗药物耐药性的关键因子。能够予药物促进肿瘤细胞自身合成内源性NO与给予外源性NO相比更具有可行性，因此，对其机制的进一步研究显得尤为重要，期望找到更多促使肿瘤细胞产生内源性NO的方法以达到提高肿瘤化疗敏感性的目的。

 

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