沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎保护作用的实验研究

　　1 材料及方法

　　1．1 实验材料

　　1．1．1 动物健康Sprague'Dawley(SD)大鼠54只，雌雄不限，清洁级，体重250~300g，由苏州大学医学院实验动物中心提供。随机分为三组：SNP组(S组)、沙利度胺治疗组(T组)、对照组(C组)。

　　1．1．2 主要试剂及仪器牛磺胆酸钠(Solarbio公司)；TRIZOL(美国Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(日本Takara公司)。

　　1．2 方法

　　1．2．1 动物模型的建立SD大鼠术前禁食12h，不禁水；2％戊巴比妥钠(40mg／kg)腹腔内注射麻醉后，消毒腹部皮肤，正中切口入腹，从胆胰管开1：3插入套管针，经微量注射泵缓慢匀速(0．1ml／min)注入4％牛磺胆酸钠(0．1ml／100g)；5min后去除动脉夹，关腹。S组和T组动物先制成大鼠SNP模型。

　　沙利度胺25g溶于500ml橄榄油中，备用。模型成功后S组不作其他处理；T组建模后1h沙利度胺(200mg／kg)灌胃。C组只开腹翻动胰腺后随即关腹，不作其他处理。术后3h、6h、12h三个时间点处死大鼠，每个时间点6只大鼠。

　　1．2．2 检测指标：检测各组血清的TNF— ，IL一6，IL一18 分别按时间点各组在相应时间点经心脏穿刺取血处死大鼠，所取新鲜血液经高速低温离心机离心(4cc，3 500r／mi10min分离血清后一20℃冰箱中保存待测。放免法测血清TNF— 、IL_6、IL一18(按试剂盒说明进行，试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司)。

　　2) 检测外周血CD4+．CD8 的T细胞水平变化：取专用试管3支，各试管加入大鼠外周血标本100txl，分别ⅡCD3一FITC／ICOS-PE，CD4一FITC／CD8一PE单克隆双色抗体5pJ，然后与之充分混匀，室温避光下孵育15min，然后每管加入10~FACS(细胞裂解液)溶血剂2ml，充分混匀，室温避光下溶血10 min至完全透明，1500r／rain离心10rain，弃上清液，PBS洗涤3次，每管加入0．5 mlPBS液悬浮，混匀放置室温下待测。用美国Beck．man公司生产的流式细胞仪测定。

　　3)腹水量的检测开腹观察腹水性质及量(用无菌纱布塞人大鼠腹腔约5min，比较前后的重量，大体估算出腹水量)。

　　4)胰腺组织中TNF一仪mRNA的表达用半定量RT—PCR检测TNF一仪mRNA表达。取液氮冻存胰腺组织，用Trizol试剂一步法抽提胰腺样品总RNA，通过读取其在分光光度计A抛～Az m处的吸收值，测定RNA浓度和纯度。随机引物法将．RNA逆转录为cDNA，再以TNF一引物进行PCR扩增，p—actin作为内参照。TNF一仅引物上游序列为：5-CCAACAAGGAGGAGGAGAAGT一3，下游序列为：5GTATGAAGTGGCAAATCG一3，扩增片段323bp；p—actin 上游序列为：5一CACGATG—GAGGGGCCGGACTCATC～3，下游序列为：5一TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT一3，引物扩增片段241bp。PCR条件为：退火温度54℃及循环数38。

　　5)胰腺组织的病理变化观察胰腺组织大体病理变化后，取部分十二指肠区胰腺组织常规固定，HE染色。光镜下按Schmidt等描述的组织学病理分级法，由两位病理科医师用盲法评分。

　　6)胰腺组织ICAM一1免疫组化染色结果判定：以细胞膜或胞浆内呈现棕黄色颗粒者为阳性，随机观察5个具有代表性的高倍视野，并根据阳性细胞占总细胞数的比例记0~4分：阳性细胞数<5％记0分，阳性细胞数5％～25％记1分，阳性细胞数26％-50％记2分，阳性细胞数51％～75％记3分，阳性细胞数>75％记4分。

　　2 结果

　　2．1 血清的TNF一仅、IL一6、IL一18的变化在3、6、12h S组的IL一6水平较C组明显增高(P<0．05)，在6、12h T组的IL一6水平较S组明显降低(P<0．05)，在3、6、12h S组的IL一18水平均较C组明显增高(P<0．05)，在12h T组的IL—l8水平较S组显着降低(P<O．05)。在3、6、12h S组的血清TNF一水平均较C组明显增高(P<0．05)，T组较S组显着降低(P<O．05)。

　　2．2 外周血CD4+,CD8 的T细胞水平变化S组和C组相比，CD4细胞在3、6h显着增高(P<0．05)，12h显着降低，CD8q'细胞在6、12h显着下3 讨论．SNP发病机制十分复杂，研究表明胰腺腺泡细胞的破坏是胰腺炎发生的起始事件，随之多种酶的级联激活、炎症因子及多种炎性细胞的激活和相互作用引起SIRS，最终导致MODS。因此SNP目前仍有20％~30％的死亡率嘲。

　　目前认为细胞因子增加在全身并发症发生之前，是促使并发症发生的早期炎症介质，TNF一能作用于多种细胞，在细胞和亚细胞水平上激发一系列级联反应。IL-6是炎症反应中的重要介质，参与急性相反应诱导细胞间黏附分子-1(I—CAM一1)和血管细胞黏附分子(VCAM)的表达，导致炎症进展，并且可直接作用于血管内皮细胞，使其通透性增加，导致大量炎性渗出，与TNF一等协同，构成炎症介质网络。急性胰腺炎时单核巨噬细胞可在脂多糖(LPS)、TNF-ot等诱导下产生IL一6，体外CAPAN一1和CAPAN一2细胞株也能对LPS或TNF一仪产生浓度依赖性应答表达IL一6，提示胰腺细胞亦能产生IL一6，主动参与AP发病机制。

　　本实验研究发现在SNP建模成功后血清TNF-c~始终保持在较高水平，对胰腺组织TNF一 mRNA检测也证实同样的结果，表现为建模成功后的胰腺组织rINF一 mRNA较对照组表达明显增高。而IL一6检测结果表明在建模后随着时间的推移逐渐升高。以上实验结果表明SNP发生后，TNF一在机体的炎症反应中处于始动地位，对细胞因子的级联释放具有重要意义，起到“扳机”样作用，促进炎症细胞的迁移，并刺激靶细胞产生IL一6等炎症因子，引起连锁和放大反应，即所谓的“瀑布效应”，进一步出现SIRS，并可进一步发展为MODS。如何调整炎症反应，使炎症因子维持一种低水平的平衡状态，可能是治疗SNP的合理措施。

　　Moreirat等在研究中发现。沙利度胺可抑制由LPS诱导的TNF—的产生，从而抑制炎症反应，在给大鼠注射致死剂量的LPS前先给予该类似物，可极大地抑制内毒素性休克，并分析这一效果可能是通过使TNF一仅mRNA水平下降，下调TNF-a和一氧化氮的产生而产生的。本实验研究发现模型组和治疗组在建模后3h血清中的TNF—OL都出现增高，并且模型组始终保持在高水平状态，而治疗组血清中的TNF一随着时间的延长逐渐降低，说明沙利度胺具有抑制SNP时TNF表达的作用。本实验发现沙利度胺处理SNP大鼠后在6h和12h时IL一6较模型组明显降低，从另一侧面证实了沙利度胺对SNP的治疗作用。进一步对胰腺组织TNF一 mRNA表达的检测发现，沙利度胺的干预能明显下调胰腺组织TNF—mRNA表达，从而缓解胰腺的局部炎症反应。

　　IL一18是由库否细胞及活化的巨噬细胞产生，能在内毒素血症时刺激机体产生IFN一，Ueda等研究表明，IL一18在急性胰腺炎并发多脏器功能衰竭患者中显着升高，阻断IL—l8是治疗SNP并发多脏器功能衰竭的重要途径。本实验研究发现治疗组IL-18较模型组中降低，其中12h时具有统计学意义等。研究发现，IL—l8的表达和ICAM一1的表达具有相关性，并参与了急性胰腺炎并发多脏器功能衰竭。本实验研究表明沙利度胺能抑制SNP中ICAM一1的表达，说明沙利度胺不但能抑制SNP胰腺局部的炎症反应，减轻胰腺的水肿和坏死，还能通过抑制系统炎症反应，减轻多脏器功能衰竭。

　　Ueda等研究发现SNP患者入院后14天时的CD4 和CD8叩细胞数量减低和继发感染相关。

　　本实验中治疗组12h的CD4 和CD8+1细胞数量均较模型组增高，表明沙利度胺对SNP时的免疫紊乱具有一定的调节作用，从而减少继发感染的发生。综上所述，沙利度胺对大鼠SNP时的炎症反应具有抑制作用，其机制是沙利度胺可能通过抑制TNF—d mRNA的表达，减少炎性介质的释放，并通过调节免疫紊乱，减轻SNP的病理损害。

　　本文由学术期刊吧整理发布，转载请注明出处！

我要分享到：

职称论文发表交流平台！

沙利度胺对大鼠急性坏死性胰腺炎保护作用的实验研究

最新文章NEWS

推荐期刊Tui Jian

热点文章HOT