冠状动脉微栓塞后Toll样受体4的变化

　　冠状动脉斑块破裂或血栓脱落等引起的冠状动脉微栓塞(coronarymicroembolization，CME)可导致心肌缺血、坏死，引起重度心律失常、心室收缩功能障碍。本研究采用冠状动脉介入方法建立的猪CME模型，探讨CME后Toll样受体4(Toll—likereceptor4，TLR4)的变化情况。

　　1资料与方法

　　1．1实验动物12周龄的健康小型家猪12头，体质量21～25kg，实验组和对照组各6头。

　　1．2微栓塞球制备取直径42／xm的微栓塞球10～15L(Dyno公司，挪威)，放入1．5mL离心管中，管中再加入1mL弱0．9氯化钠液，显微镜下计数；然后取15万个微球放人60mL离心管中，加入0．9氯化钠液配成40~45mL悬液。每次使用前剧烈震荡5s，将悬液抽入6OmL注射器内，然后用5mL0．9氯化钠液冲洗2次。

　　1．3动物模型建立肌内注射氯胺酮(5mg／kg)，以地西泮(10mg／kg)和阿托品(0．08mg／kg)诱导麻醉后，用3戊巴比妥维持麻醉。建立耳静脉通道，滴注0．9氯化钠液。分离右侧股动脉，置入7F动脉鞘，经鞘管首剂给予肝素200U／kg，此后每1h静脉注射肝素100U／kg，维持肝素化。

　　用数字减影血管造影仪行冠状动脉造影，送入7FEBU3．5指引导管至左冠状动脉Vt，确定前降支位置及分布。送入微导管(3．0／2．8F)至前降支中段，经微导管将微栓塞球悬液注入前降支内，再用10mL0．9氯化钠液冲洗微导管并注入冠状动脉内，制成CME动脉模型(研究组)。对照组则在其前降支注人等量的0．9氯化钠液。然后两组再次行冠状动脉造影。

　　1．4样本采集和分析

　　1．4．1样本采集1周后静脉注射30氯化钾30ml，处死CME模型猪，取出心脏，平行于房室沟切块，前壁、后壁各取5块质量为50～100mg的心肌组织，液氮冷冻后移入一70。C冰箱，用于RNA及蛋白分析。

　　1．4．2蛋白质印迹(Western-blot)取50～100mg心肌组织，提取蛋白并用二可辛酸(bicinchoninincacid，BCA)法定量，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。TLR4抗体购自SantaCruz公司。

　　1．4．3实时聚合酶链反应(real—timepolymerasechainreaction)取50～100mg心肌组织，提取其RNA后进行逆转录；外源性TIR4、内参GAPDH均由上海生工公司合成，TLR4引物序列正义链及反义链分别为CTCTGCCTTCACTACAGAGA3和5一CTGAGTCGTCTCCAGAAGAT3，GAP—DH引物序列正义链、反义链分别为5TCATCAGCAATGCCTCCTGTACCA一3和5LTATTTGGCAGGTTTCTCCAGACGG。扩增方案：94℃加热5min；然后94。C加热30S、55。C加热30S、72。C加热30S，循环进行4O次；72C延伸10min。

　　1．5统计学处理采用SPSS15．0软件进行统计分析。2组之间比较采用两独立样本的t检验。P％0．05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2．1心肌组织TLR4蛋白水平猪心肌组织TLR4蛋白水平见图1。CME1周后实验组心肌组织前壁TLR4蛋白水平显着高于后壁(P％O．05)。而对照组前壁、后壁TIR4蛋白水平和CME组后壁相比，差异无统计学意义。

　　2．2心肌组织TLR4mRNA水平猪心肌组织TLR4mRNA水平见表1。CME1周后实验组心肌组织前壁TIR4mRNA水平显着高于后壁(P<()．05)；而对照组前壁、后壁TLR4mRNA水平与CME组后壁相比，差异无统计学意义。

　　3讨论

　　CME后会引发局灶性心肌微梗死和一过性心肌收缩功能障碍，但1周左右可恢复。由于冠状动脉微血管网丰富，多处心肌坏死可引起局部心肌收缩功能障碍，但这并不是导致心肌收缩功能减弱的主要原因。目前认为，炎性反应是CME后心功能变化的主要发生机制。

　　TLRs家族在病原体的识别和激活天然免疫方面发挥着非常重要的作用。激活的TIRs不仅可以诱导天然免疫应答，而且有利于特异性免疫反应发生。TLR4在体内分布广泛，分布于心肌中的TLR4与心血管疾病关系密切。心力衰竭的病理机制复杂，炎性反应也参与了这一过程。在心力衰竭的动物模型和患者中，TLRs被激活，且其分布形态发生了变化。在正常大鼠和人心肌中，TIR4弥散分布，主要分布在心肌内；而在心力衰竭患者中，TIR4呈局灶性聚集分布。

　　本研究发现，心肌TIR4表达在CME1周后显着升高，而后壁与对照组前后壁无显着差异，提示TLR4可能参与了CME后的炎性反应。

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