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LyGDI基因转染对肺腺癌A549细胞生长及放化疗敏感性的影响

　　1材料与方法

　　1．1主要材料肺腺癌A549细胞由本实验室冻存。pEGFP．LyGDI及pEGFP．C1真核表达载体由本实验室构建。DMEM培养基、新生小牛血清购自美国Gibco公司；脂质体(Lipofectamine。M2000)购自美国In—vitrogen公司；G418购自上海前尘生物公司；甲基偶氮唑蓝(MTT)购自上海生工生物工程有限公司。

　　1．2方法

　　1．2．1细胞培养A549细胞常规采用含10％新生小牛血清的DMEM培养基，在。37％、5％CO2培养箱内培养。正常情况下细胞贴壁生长，每2d换液1次，每3～4d传代1次。

　　1．2．2稳定转染接种各组细胞于35mm培养皿中培养，当细胞达80％一90％融合时，按Lipo—fectamine2000说明书，将pEGFP—LyGDI载体转染人A549细胞(A549-LyGD组)。以转染pEGFP—C1空载体(A549．C1组)及不转染细胞为对照。培养24h后，按500g／ml加入G418继续培养，约2周可筛选出阳性细胞克隆，分别命名为A549一LyGDI及A549．C1，进行扩增培养。

　　1．2．3免疫荧光细胞化学染色在6孔培养板中制备细胞爬片；爬片经0．01mol／L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗、4％多聚甲醛固定、0．3％HO处理及山羊血清封闭后，加人1：500羊抗人LyGDI一抗(不加一抗为阴性对照)，37℃孵育60min，4℃过夜，PBS漂洗后加入1：500异硫氰酸荧光素(FITC标记二抗，37℃孵育30min，再次PBS漂洗后用50％缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察并照相记录，观察转染情况。

　　1．2．4RT—PCR检测转染细胞中LyGDImRNA表达水平以6-actin作为内参照，上游引物：5’一ACGAC—CCA1_rCGAACGTCTG．3’，下游引物：3’一CTC—CCTCGGACTC1TITrGCC_5’，扩增产物500bp。LyG—DI上游弓l物：5’-ATGGATCCAGCAAGCTCAATTATAAGCC一3’，下游引物：5’一ATGAArI3"CATI'CTGTCCACTCC1_rC仉ATCG一3’，扩增片段大小为600bp，RT．PCR操作按说明书进行。

　　1．2．5细胞生物学特性观察(1)平板克隆形成试验计算克隆形成率[克隆形成率(％)=克隆数／接种细胞数X100％]，重复4次。(2)将转染后A549一LyCDI组细胞与A549．C1组细胞以10个细胞／#L的密度接种于6孔细胞培养板，每组设3个复孔，共计7板。接种后第1—7天，用血细胞计数板计算细胞数，重复3次，取平均值，描绘细胞生长曲线，根据公式tD=t×(1g2／lgnt—lgn0)计算细胞倍增时间(式中t为培养时间)。(3)体外划痕试验：以合适密度接种各组细胞至35mm培养皿，待细胞长满平皿后，用200g无菌移液器枪头，垂直、均匀地进行划痕，而后用PBS洗去细胞碎片，此为0时刻，分别于0时刻、12、24、36h于倒置显微镜下观察、拍照。

　　1．2．6检测LyGDI对A549细胞化疗敏感性的影响实验分A549LyGDI组和A549一C1组。取处于对数生长期的两组细胞，胰酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数。用培养基调整其浓度至1X10／ml，每次每孔取100l接种至96孔板，贴壁过夜。将常用化疗药物顺铂(DDP，齐鲁制药)用DMEM培养液配制，设5个剂量组(DDP终浓度分别为0、2．5、5．0、10、20g／m1)和对照组，每组设5个复孔。

　　DDP处理48h后，每孔加MTI"溶液(5mg／m1)2Ol，继续孵育4h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150IxlDMSO，振荡10rain，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上测定各孔490nm波长处的吸光度(A柏。)值，记录结果，取平均值。

　　1．2．7检测LyGDI对A549细胞放射线敏感性的影响两组细胞(A549．LyGDI和A549一C1)分别以500、1000、2000、4000、10000的密度接种于60mm细胞培养皿，0、2、4、6、8Gy∞Co3'射线照射后，培养箱内培养10d，吉姆萨染色，采用克隆形成试验观察转染LyGDI基因对A549细胞的放射敏感性(克隆形成率，计算方法见1．2．5段)。

　　1．3统计学处理应用SPSS16．0软件进行统计分析，数据以±s表示，组间比较采用SD-t检验，双侧检验，P<0．05表示差异有统计学意义。

　　2结果

　　2．1LyGDI基因稳定转染A549细胞的建立和筛选

　　2．1．1FITC检测细胞荧光表达情况LyGDI表达质粒转染A549细胞和对照空载体，24h在激光共聚焦显微镜下观察，A549．LyGDI细胞在紫蓝色光激发下发出绿色荧光，而A549．C1细胞则未见荧光(图1)，可以间接说明转染成功。

　　2．1．2RT—PCR检测LyGDI的表达量RT-PCR结果显示A549一LyGDI细胞中LyGDImRNA转录水平较A549一C1细胞和A549细胞上调，提示转染成功(图2)。2．2LyGDI基因对A549细胞生物学行为的影响

　　2．2．1克隆形成率A549细胞转染LyGDI基因后，A549-LyGDI组和A549-C1组的克隆形成率分别为(40．1±4．9)％和(60．2-4-7．1)％，前者克隆形成率显着弱于后者(P<0．01)。

　　2．2．2MTT测定细胞生长曲线A549一LyGDI和A549．C1组转染细胞与野生型A549细胞生长曲线形态相似。细胞群体平均倍增时间分别为(18．6±1．0)h和(26．3±2．3)h(图3)，与A549一C1组细胞比较，A549-LyGDI组细胞生长速度减慢，细胞倍增时间明显延长(P<0．05)。

　　2．2．3体外划痕试验检测细胞浸润情况如图4所示，划痕后12h与划痕后0时刻相比，3种细胞划痕间隙未见明显缩小。24h后空白对照的A549细胞与空载体的A549一C1细胞已经快速浸润扩散覆盖了划痕间隙，其细胞划痕间隙明显缩小，而A549．LyGDI细胞间隙略有缩小，相对于前两种细胞较宽，36h这种差别更加明显。结果表明LyGDI可以抑制肺腺癌A549细胞的浸润。

　　2．3LyGDI基因对A549细胞化疗敏感性的影响如表1所示，经48h连续给药(DDP)处理后，A549一LyGDI组和A549一C1组细胞均可引起生长增殖抑制并呈浓度依赖性。在同一药物浓度下，A549．LyGDI细胞存活率显着降低(P<0．05或<0．01)，说明LyGDI可以抑制对数生长的A549细胞的生长，LyGDI可提高A549细胞对化疗的敏感性。

　　2．4LyGDI基因对A549细胞放射敏感性的影响由表2可见，两组细胞随∞co射线剂量的增加，克隆形成率均明显降低，且A549一LyGDI细胞较A549一C1组细胞克隆形成率明显降低(P<0．05)，但8Gy时的差异无统计学意义(P>0．05)，提示LyGDI增加了A549细胞的放射敏感性。3讨论LyGDI(又称RhoGDI-2，I)4-GDI或RhoGDI~)主要在人和鼠类的造血组织中表达，由201个氨基酸构成。LyGDI具有与RhoGDI家族其他成员不同的独特的作用机制，深入研究LyGDI基因的生物学功能，对寻找肿瘤治疗的新靶点具有重要意义。

　　近年来很多研究已经证实，LyGDI基因参与肿瘤的侵袭性和转移性。近来研究表明，LyGDI还在肺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌等肿瘤组织中表达，但不同肿瘤细胞中LyGDI的表达水平存在很大差异，其在不同肿瘤进程中的作用也不同。如Zhang等发现，LyGDI在转移性强的MDA—MB-231细胞中过度表达而在转移性弱的MCF-7细胞中几乎检测不到，并证实LyGDI的过度表达与肿瘤细胞的侵袭性和移动性相关：通过抑制MDA．MB-231细胞中LyGDI的表达，可以完全阻止该细胞的侵袭性，并使该细胞恢复到正常的乳腺上皮细胞形态学的表型。Hu等发现，LyGDI在乳腺癌中的表达呈现双相模式：在增生性和原位恶性的乳腺组织中，LyGDI上调表达，而在转移性的乳腺组织中，LyGDI的表达下调且这一现象与淋巴结转移相关。他们认为肿瘤发生早期的LyGDI表达上调具有抑制肿瘤发生、发展的意义，而晚期的LyGDI表达下调则有助于乳腺癌肿瘤的进展。Gildea等J和Michael等发现，被动表达的LyGDI能抑制癌细胞的恶性程度，尤其膀胱癌中的LyGDI被认为是肿瘤侵袭和转移的抑制因子。Ota等的研究发现，LyGDI在C端的166～201序列丢失，使△C—LyGDI与Rac一1形成复合物并锚定于细胞膜上，提高Rac一1GTPase的活性，从而改变了Rasl000细胞的侵袭性。目前LyGDI在肺腺癌细胞转移和入侵的机制还不清楚。

　　我们利用脂质体法将外源性LyCO转入肺腺癌A549细胞，结果显示A549．LyGDI细胞克隆形成能力降低，细胞增殖能力减弱，倍增时间延长，划痕实验观察到稳定转染LyGDI的细胞向划痕区域的迁移速度较空载体对照组减慢，这一实验结果提示LyGDI抑制了肺腺癌A549细胞的侵袭性。肿瘤的放、化疗主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而杀灭肿瘤细胞，但肺癌细胞大多对化疗药物和放射线不敏感，其主要原因是细胞的凋亡机制受损，使细胞凋亡减少，耐药性增加，或在治疗过程中肿瘤细胞凋亡信号的改变或缺失，或是抗凋亡基因的表达上调。我们发现LyGDI体外转染到肺腺癌A549细胞后，LyGDI过表达可抑制肺癌细胞的生长，促进化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，与空载体对照组相比，能提高化疗药物的敏感性，并对化疗药物有剂量依赖性。但具体机制不清楚。在GDI家族成员中，Zhou等。现LyGDI是唯一能够在辐射诱导的细胞凋亡中发生断裂，并推测辐射诱导LyGDI断裂导致了Racl和Cdc42激活NADPH氧化酶，进一步激活caspase．3，促进细胞凋亡。我们实验室以前在研究放射线诱导细胞凋亡中发现，稳定转染LyGDI的肺腺癌A549细胞比对照组空载体组的辐射敏感性强，结果和Zhou等。的结果相吻合。因此，LyGDI增加肺腺癌A549细胞对化疗和放疗的敏感性有一定的临床意义。至于LyGDI对A459细胞其他的生物学特性的影响，我们正在进一步研究。

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