IRE1一TNAF2信号转导通路在Hcy诱导PC12细胞凋亡中的作用

　　一、主要实验材料和分组

　　1．PC12细胞(武汉大学典型培养物储藏中心)，Hcy(美国Sigma公司)，IRE1、TNAF2、Caspase一12和-actin扩增引物(上海生物工程公司合成)。

　　2．细胞培养和分组PC12细胞接种在含10％胎牛血清和100 ng·ml NGF的DMEM高糖培养基中，5％CO2培养箱中37℃培养。按2×10 个·ml 接种于6孔培养板中。实验细胞按Hcy浓度分为6组，分别加入终浓度为(对照组)O．1、0．5、1．0、5．0和10．0 mmol·L 的Hcy，共同孵育24h。

　　二、实验方法

　　1．MIT法检测细胞存活率分别在不同时间点(0、6、12、24和48 h)加Hcy(5 mmol·L～)200L，然后每孔加入不含血清培养基18O L和5．0 g／MTT 20p,L，37％孵育4 h，弃去上清，再加入DMSO 200~L，于37℃孵育2O一30 min，至颗粒溶解，在酶标仪上读取570／lm处的吸光度值。

　　2．流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率收集各组细胞，按凋亡检测试剂盒说明操作。

　　3．RT-PCR测定IRE1、TRAF2、Caspase一12 mRNA的表达收集分组处理后各组细胞，Trizol法提取总RNA，按两步法RT．PCR试剂盒检测IRE1 mRNA、TRAF2 mRNA、Caspase．12 mRNA的表达。

　　IRE1引物上游、下游序列分别为：5：CCCTGATAGGTrGAATCCTGGC rATGTG一35"-AATCTATGCGCTAATCTGCTGGCCTCTG一3扩增长度209bp。TRAF2引物上游、下游序列分别：5-CCATGTCAGAACGTGCAGTAA-35"-TGGCCTCTATCTIGGACACC一3扩增长度为710bp。Caspase一12引物上游、下游序列分别为：5-TGGATGGAGTIqq~GATGACC一3，5：AGT，GGCTATCCC础CTrG一3 扩增长度为884bp。D-actin为内参照，其引物上游、下游序列分别为：5：AGAGCAAGAGAGGCATCCTG一3：5：GcTcGAAGTcTAGGGcAACA一3 扩增长度为498bp。

　　PCR扩增的条件：变性94％ 1 min，退火59qC 1min，延伸72℃ 2min，共循环35次。扩增完毕后取PCR产物于1．5％的琼脂糖凝胶电泳上检测，凝胶图像分析仪分析，根据目的基因与内参基因电泳条带灰度的比值，进行IRE1、TRAF2和Caspase-12的相对表达量分析。

　　三、统计学处理SPSS12．0软件进行统计学分析，计量资料以元±s表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验。以P<0．05为差异有统计学意义。

　　结果

　　1．MTY法检测PC12细胞吸光度和存活率(表1随Hcy作用时间延长，PC12细胞吸光度和存活率逐渐降低(P<0．05)。

　　2．流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡率(图，表2)随Hcy浓度增加，PC12细胞凋亡率逐渐增高。

　　3．IRE1、TRAF2及Caspase一12 mRNA表达(表3)与对照组比较’尸<0．05不同浓度Hcy作用PC12细胞24h后，与对照组比较，随浓度增加IRE1mRNA、TRAF2 mRNA 和Caspase．12 mRNA表达逐渐上调。

　　4．5mmol／L Hcy不同时间作用于PC12细胞后，IRE1、TRAF2及Caspase一12 mRNA表达(表4)5mmol／L Hcy不同时间作用于PC12细胞后，与对照组比较，随作用时间延长IRE1、TRAF2 以及Caspase一12 mRNA表达逐渐上调。

　　讨论内质网是蛋白质修饰折叠和贮存钙的主要场所，对应激极为敏感，保持其功能正常是细胞存活的必要条件。当环境中的毒性物质、高Hcy及异常糖基化反应时，未折叠蛋白质增多，可引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS) 。ERS对决定应激细胞的变化如抵抗、适应、损伤或凋亡有重要作用。适度的ERS反应有助于保护细胞，维持生存。

　　ERS过强时，促凋亡机制占主导，能诱导细胞凋亡，促进疾病的发生和发展。ERS有一套自身的信号传递通路。IRE1是ERS条件下对维持细胞存活有非常重要作用的跨膜蛋白，是第一个被发现的对未折叠蛋白聚集作出反应的分子，具有核酸内切酶的作用。

　　ERS时IRE1募集TNAF2并与之结合到内质网膜上，导致TNAF2与easpase一12前体复合物解离，caspase．12活化，引起细胞凋亡。在此通路中TRAF2是将凋亡信号从内质网传向胞浆的关键介质。只有当IRE1和TRAF2都被激活，才能表明有内质网死亡信号(细胞凋亡反应)存在。本实验发现PC12细胞经Hcy处理后，IRE1和TRAF2 mRNA表达均明显上调，表明IRE1一TRAF2信号通路被激活。caspas蛋白水解酶，是最终执行细胞凋亡的水解酶。Caspase家族中仅caspase一12位于内质网浆，以前体形式存在，是ERS反应诱导凋亡的关键分子，仅特异性被ERS信号通路裂解激活，与非ERS介导的凋亡机制无关，且caspase一12是ERS特异凋亡通路中的起始因子。

　　IRE1一RAF2复合物可促使Caspase一12酶原聚集和活化，激活Caspase-12，从而诱导细胞凋亡。本实验发现经Hcy处理后，PC12细胞活力明显下降，凋亡率显着增加，IRE1 mRNA，TRAF2 mRNA和caspase一12 mRNA表达明显上调，且呈浓度和时间依赖性。研究显示Hcy可激活ERS通路的IRE1．TRAF2．caspase12信号转导路径，导致PC12细胞凋亡。

　　Hcy是一种含硫氨基酸，在细胞内主要有两种代谢途径，再甲基化途径和转硫途径。本实验显示Hcy作用于PC12细胞后，细胞活力降低，细胞凋亡率增加，IRE1一TRAF2 mRNA表达增加，caspase一12 mRNA表达也增加，并呈浓度和时间依赖性。分析其机制与Hcy含有活泼的自由巯基有关。活性巯基作为一种还原性物质改变细胞内的氧化还原状态，产生氧化应激反应，使折叠蛋白质中的二硫键断裂，形成非折叠的蛋白质，后者不能顺利地转运至高尔基体，也就不能分泌到细胞表面或细胞外而在内质网中大量聚集，促进引起ERS的各种基因表达。本实验结果与Shastry等¨研究相同。Lentz研究显示Hcy可与内质网蛋白发生二硫键交换反应，引起新合成的分泌蛋白、膜蛋白错误折叠。

　　综上所述，IRE1．TRAF2转导通路的激活是Hcy介导PC12细胞凋亡的重要途径，但可能不是唯一信号途径。因为ERS是新发现的信号转导系统，涉及到多路径及许多基因的表达调控，而且PD的发病机制也很复杂。对ERS详细的分子机制及相互作用网络的进一步研究，必将促进对PD病理机制的深入认识。

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