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去铁胺对小鼠糖尿病随意型皮瓣成活影响研究

　　1 材料与方法

　　1．1 动物及分组选择6～8周健康C57／BL6雄性小鼠16只，体重22—25 g，饲养温度23—27，术后分笼喂养。随机分为DFO处理组和磷酸盐缓冲液介质组，每组各8只。

　　1．2 2型糖尿病小鼠模型的制作柠檬酸盐缓冲液(柠檬酸盐：柠檬酸三钠=1：1，pH 4．4)溶解链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma)，浓度10 mg／ml，50 mg·kg～ ·d 腹腔注射，连续注射5 d，约1周后出现活动减少、反应迟钝、多饮、多食、多尿、体重减轻症状，测空腹血糖浓度>16．7 mmol／L，可判断为造模成功。每周监测1次血糖，剔除血糖值转阴小鼠，再次注射造模。

　　1．3 皮瓣模型制作手术前3 d用脱毛膏将小鼠背部毛脱净，清水清洗。手术前夜，实验动物禁饮食。腹腔内注射3％戊巴比妥钠70 mg／kg进行麻醉，麻醉成功后俯卧位固定小鼠，皮肤乙醇消毒。设计蒂在小鼠颅侧随意皮瓣，1 cm×3 am，皮瓣长轴和小鼠长轴一致，皮瓣内无轴性血管穿过。为确定形成一个从蒂部到远端的局部缺血梯度，我们在随意皮瓣和下方肌肉层之间插入一片薄硅胶膜，以隔绝肌层对皮瓣的营养干扰。

　　1．4 给药方法DFO处理组：根据前期的实验，确定DFO 100 mg／kg为有效注射量，小鼠腹腔内注射，注射时间分别为皮瓣手术前1 d，手术前1 h，术后2d，每天1次。PBS介质组：腹腔注射等量的PBS，注射时间与DFO组相同。

　　1．5 检测(1)皮瓣成活率：术后7 d处死动物，取皮瓣照相。利用软件Image Pro Plus 6．0分析，求出皮瓣存活面积和总面积之比以及皮瓣存活率。

　　(2)组织学检查：术后7 d切取皮瓣，包括皮下组织及内膜层，4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，于皮瓣正常组织到坏死组织交界处切片，观察血管数、组织水肿、炎性细胞、成纤维细胞生长等。(3)激光多普勒检查：术后7 d，小鼠麻醉后，俯卧位于激光多普勒血流成像仪(英国摩尔公司)下进行扫描皮瓣，从皮瓣蒂部到尾部均分为三等分进行血流分析。

　　1。6 统计学方法采用t检验。

　　2 结果

　　2．1 皮瓣成活面积术后7 d DFO组皮瓣的存活面积比(88．44±6．56)％ ，PBS组皮瓣的存活面积(61．64±7．63)％ 。DFO组皮瓣存活面积大于对照组(t=7．53，P<0．01)。

　　2．2 皮瓣的组织病理变化 (1)肉眼观察：术后7d，对照组内膜下可见小淤血块，组织水肿严重，远端皮瓣组织出现大面积的坏死区域，呈现焦痂样，皱缩，质硬；实验组，内膜下未见淤血块，组织水肿程度较对照组轻，色泽淡红，远端出现小面积坏死区域，皱缩程度较对照组轻。(2)HE染色：DFO实验组，表皮层变薄，部分缺失，皮下组织水肿明显，大量毛细血管增生，出现于内膜深层，血管扩张；有中性粒细胞浸润，皮下大量纤维细胞增生(见图1)。PBS对照组皮下组织水肿明显，内膜深层见少量毛细血管增生，血管扩张，中性粒细胞浸润。表皮层部分缺失，角质层部分缺失、变薄(见图2)。

　　2．3 激光多普勒术后7 d，小鼠麻醉后置于激光多普勒探头下扫描。从皮瓣蒂部到远端均分为三部分，输出相对血流值分别为蒂部>中段>远端(见图3、4)，且DFO处理组各部分血流灌注值均大于PBS处理组(P<0．01)(见表1)。

　　3 讨论DFO是从多绒链霉菌中提取出来的一种羟胺，对铁离子具有极高的亲和力而具有结合铁的能力，本用于治疗铁超载等铁代谢疾病，本实验结果显示，DFO对于糖尿病小鼠皮瓣的存活有着积极作用，DFO组皮瓣存活率(88．44±6．56)％ ，大于PBS介质组(61．64±7．63)％。通过比较，我们认为机制可能与以下几个方面有关：(1)改善皮瓣微循环：

　　皮瓣形成后能否全部成活，取决于血循环量是否满足皮瓣各部分组织代谢所需。DFO对糖尿病血管的再生有着积极的作用。本实验发现，实验组的缺血部位血管增殖大于对照组，激光多普勒显示DFO处理组皮瓣从蒂部到远端的三部分血流灌注均大于PBS介质组(P<0．01)。有学者 报道，DFO可以促进血管内皮生长因子的过度表达来增进新生血管的生成。因为DFO在缺氧条件下能诱导低氧诱导因子的生成 ，而低氧诱导因子诱导血管内皮生长因子的产生，增加血管生成，使血液到达缺氧部位，营养组织。这些需要我们进一步的实验来证明。(2)减轻自由基损伤：糖尿病患者体内游离铁增高，主要是因为血红蛋白和转铁蛋的糖化，导致了蛋白与铁离子的分离。铁离子是产生自由基的催化剂。自由基会造成细胞膜脂质过氧化，通过氧化应激过程加重低氧对细胞的损害。细胞膜结构损伤后，不但膜酶受损，而且使细胞膜失去其分隔功能，导致膜结构的流动性下降和膜的通透性增加，从而造成细胞的死亡。DFO对培养液中铁离子的螯合作用能够减轻低氧过程中氧化应激对细胞的损伤 。

　　目前，已有一些DFO作用于皮瓣的研究，而其对于糖尿病皮瓣的研究尚属首次。由于糖尿病的存在，体内由糖尿病引起的一系列的因子和细胞的变化使得缺血部位的血管化异常。DFO通过多种途径，包括减轻自由基伤害和促进血管化来提高糖尿病皮瓣的成活面积。虽然在DFO的作用机制、最佳作用时间和剂量上尚有许多问题需要进一步研究，但是，作为一种很有潜力的药物，其对糖尿病皮瓣成活的改善是明显的，继续深入研究其机制和临床应用具有一定的价值。

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