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聪智灵对拟血管性痴呆小鼠海马乙酰胆碱酯酶的影响

　　木血管性痴呆(VD)是因脑血管因素所致的智能及认知功能障碍临床综合征。近年来，随着老龄人口不断增加，VD发病率呈现增高趋势。VD的发病机制目前尚未完全探明，现代医学尚缺乏系统有效的治疗手段，临床对VD的防治多属于对症治疗，‘1而中医药在防治脑血管病方面的优势已得到临床验证。本研究通过复制脑缺血再灌注VD小鼠模型，观察中药复方聪智灵对VD模型小鼠学习记忆能力及海马组织乙酰胆碱酯酶(Ache)活力的影响，探讨聪智灵对VD的治疗效应及作用机制，为中医临床治疗VD提供实验依据。

　　1材料与方法

　　1．1实验动物健康雄性昆明小鼠100只，体质量25g～30g，由河北省实验动物中心提供(昆明小鼠二级实验动物，合格证号：612159)。

　　1．2实验材料

　　1．2．1药物：聪智灵由葛根、黄芪、当归尾、桃仁、红花、地龙、石菖蒲等中药组成，常规水提纯法制成1g生药／mL，课题组自制，冰箱保存，备用。尼莫地平片由河北医科大学制药厂生产(批号：H13022049)，实验时用蒸馏水配制成浓度为3mg／mL的混悬液。

　　1．2．2主要试剂：Ache试剂盒：南京建成生物工程研究所生产，批号：20041115。

　　1．2．3主要仪器：小鼠跳台仪，中国医学科学院药物研究所；HM一200型电子天平，日本OLYMPUS公司；MSE一25型高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；半自动生化仪(Humalyzer2000)，美国。

　　1．3动物分组和模型制备将小鼠随机分为5组：假手术组、模型组、聪智灵高剂量组(简称高剂量组)、聪智灵低剂量组(简称低剂量组)、尼莫地平组。参照文献制作脑缺血再灌注拟血管性痴呆动物模型。将动物用10％水合氯醛0．35g／，kg腹腔注射麻醉，颈正中部常规消毒后切口，分离双侧颈总动脉，套“4”号丝线扣，拉紧丝扣，阻断血流20rain，同时在距尾尖1cm处剪断放血约0．3mL，热凝止血。松开丝扣使血液灌注10min后，再次阻断血流20min，第2次再灌后观察30rain，缝合皮肤。假手术组只分离颈总动脉，穿线但不结扎，尾部不放血，观察时间与其他组相同。术后每日肌注青霉素0．2万u．连续3d。本实验维持动物肛温(36±0．5)℃，防止低温对缺血所致脑损伤的保护作用。

　　1．4治疗方法术后当天动物苏醒后开始治疗。假手术组与模型组均灌服蒸馏水10mL／kg体质量，尼莫地平组灌服尼莫地平液30mr,／kg体质量，低剂量组灌服聪智灵液29g／kg体质量(相当于临床成人用药量的1O倍)，高剂量组灌服聪智灵液58kg体质量(相当于临床成人用药量的20倍)。各组均1次／d灌胃，连续治疗15d。

　　1．5指标检测

　　1．5．1行为学检测：于造模第15d治疗结束后进行。采用跳台实验。实验装置是一10cm×10cm×5cm的小鼠跳台反应箱，分为两间，箱底为可通36v连续电刺激的铜栅。

　　每间右后角置一直径和高均为4．5am的橡皮垫，作为小鼠回避电击的安全区。实验时先将小鼠置于跳台仪中，适应环境3rain，然后底部铜栅通以交流电，记录动物受到电刺激后跳上橡皮垫的反应时间和5rain内受电击的次数(错误次数)，作为学习成绩。24h后将小鼠置于跳台仪中适应3min，再将其置于橡皮垫上，记录第一次跳下橡皮垫的潜伏时间和5min内受电击的次数(错误次数)，作为记忆成绩。

　　1．5．2海马组织Ache活力检测：行为学检测结束后在麻醉下断头处死小鼠，冰盘上快速剖取全脑，弃去嗅球及小脑。沿矢状面方向将脑组织对称切开，取右侧脑组织，分离海马并称重，按照重量和体积比1：10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆，4℃4000r／min离心10rain，取上清液备测，采用分光光度法检测AchE活力(按试剂盒说明书进行检测)。

　　1．6统计学处理实验数据采用均数±标准差(±s)表示，应用SPSS13．0统计软件包处理实验数据，各组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD—t检验，显著性差异水平以0．05、0．01为标准(除外造模及干预过程中死亡等因素，每组各纳入1O只实验动物进行统计)。

　　2结果

　　2．1行为学检测结果表1示，模型组小鼠的反应时间明显延长，潜伏时间显著缩短，错误次数明显增加，与假手术组比较差异有非常显著性(P<0．01)；各治疗组与模型组比较，反应时间缩短，潜伏时间延长，错误次数明显减少，学习成绩与记忆成绩均优于模型组，差异有显著性(P<0．05或P<0．01)，其中，高剂量组学习记忆成绩均优于低剂量组和尼莫地平组(P<0．05或P<0．01)。

　　2．2AchE活性测定表2示，模型组小鼠脑组织海马区AchE活性较假手术组明显下降(P<0．01)，各用药组AclIE活性均显著高于模型组(P<0．01)，以聪智灵高剂量组优于低剂量组和尼莫地平组(P<0．05)。3讨论VD属于中医“果病”、“善忘”、“文痴”等范畴。中医学认为，“脑为元神之府”，“脑为髓海”，髓海充实，则神清智明。VD患者多年老体弱，元气不足，不能推动血液运行，以致脑络瘀阻，气血不得濡养脑髓，以致神明失养，灵机记性失常，出现学习障碍，记忆衰退，反应呆钝等症。

　　正如《医林改错》所云：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”可见VD为本虚标实之证，正气不足为本，瘀阻脑络为标。课题组结合临床经验，筛选具有益气活血、祛瘀通络、醒神开窍的葛根、黄芪、当归尾、桃仁、红花、地龙、石莒蒲等药物组合成复方聪智灵。本方仿补阳还五汤重用生黄芪，以其大补元气，意在气旺以促血行，祛瘀而不伤正，且气味俱轻，具有升发之性，对脑气不足、九窍不通者，黄芪实为上品：配以当归尾、桃仁、红花等药活血祛瘀；地龙通经活络；石菖蒲醒神开窍，健脑益智；葛根升举清阳之气，有利元气上充于脑，并有活血祛瘀之功(《本草拾遗》载“升者破血”)。诸药合用，可使气旺血行，瘀祛络通，脑髓得养，灵机记性渐归于常。

　　现代研究证实，益气活血中药可明显改善VD模型的学习记忆功能，]具有显著的抗VD作用；石菖蒲所含挥发油具有抑制神经细胞凋亡的作用，对痴呆模型动物学习记忆及认知功能有显著改善作用;葛根素能促进脑源性神经营养因子表达，减少神经细胞丢失，可明显改善VD大鼠的学习记忆障碍。海马是学习记忆功能非常重要的脑区。研究证实，海马直接参与了信息贮存和回忆，是缺血损伤最敏感的脑区。近年来，在痴呆发病机理中，中枢胆碱能系统的作用逐渐被认识，中枢胆碱能通路是学习记忆的主要通路，研究表明，VD的形成与中枢胆碱能系统的受损有关。乙酰胆碱(aeetyl—choline，Ach)为中枢胆碱能系统的重要神经递质，与学习、记忆等功能有密切联系。Ach由胆碱乙酰转移酶(ChAT)合成，被胆碱酯酶(Ache)分解，通过Ach受体而发挥生物学效应。如果ChAT和Ache的活性异常，将会引起Ach代谢失调，致使中枢胆碱能系统的生化改变。AchE作为Ach的水解酶，其活力变化可间接反映乙酰胆碱的含量和代谢情况。AchE是生物神经传导中的关键性酶，该酶降解Ach，当AcllE活力降低时，减弱了对乙酰胆碱的降解作用，致突触间隙的乙酰胆碱浓度增高，使突触后效应增强，提高了谷氨酸神经兴奋毒性作用。至于VD海马区AchE活性下降的可能原因是：由于脑组织缺血缺氧，使三羧酸循环障碍，提供酶生物合成时所需要的原料和能量减少；AchE分布于胆碱能神经元上，缺血再灌注损伤了海马的胆碱能神经元，致突触数量减少，ChAT活性降低，Ach生成减少，Ache的活性相应下调。

　　本实验采用双侧颈总动脉缺血再灌注复制VD模型，行为学检测结果显示，模型组小鼠学习和记忆成绩均较假手术组显著降低(P<0．01)，表明模型组学习和记忆能力障碍；益气活血复方聪智灵与尼莫地平均可提高模型小鼠的学习记忆能力，表明聪智灵与尼莫地平均具有改善VD模型小鼠认知障碍的作用，尤以聪智灵高剂量组作用明显。

　　AcIlE检测结果显示，模型组海马组织Ache活性显著低于假手术组(P<0．01)，各用药组AchE活性均显著高于模型组(P<0．01)，提示脑缺血再灌注时胆碱能神经元受损，AchE活性下降；中药复方聪智灵能提高海马区AchE活性，表明聪智灵减轻了缺血再灌注对海马区胆碱能神经元的损伤，且表现出量效关系。综上，聪智灵改善VD模型小鼠学习记忆功能的机制，可能与减轻脑缺血再灌注对海马神经元损伤，提高海马组织内AchE活性有关。

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