釉基质蛋白对牙周膜成纤维细胞增殖活性的影响

　　传统的一些治疗方法如翻瓣术等均难以达到生理性的牙周再生。在牙胚发育过程中，由上皮根鞘分泌的釉原蛋白可诱导牙囊细胞向成牙骨质细胞方向分化并在根表面形成无细胞性牙骨质。因此，有学者尝试运用釉基质蛋白用于促进牙周组织再生并初步肯定了其疗效。本文用不同浓度的EMPs作用于体外培养的人牙周膜成纤维细胞，观察EMPs作用下对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响分析EMPs，用于促进牙周组织生理性再生的机制及其之间的相互作用，为牙周组织工程寻求实验依据。

　　1材料和方法

　　1．1主要材料低糖DMEM培养基(Gibco美国)；新生牛血清(FCS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；胶原酶(Gibco美国)；釉基质蛋白(第四军医大学口腔医学院采用乙酸法从猪牙胚釉质中提取)；免疫ABC试剂盒(DAKO，美国)；DAB显色试剂盒(武汉博士德公司)；抗人波形丝蛋白单克隆抗体(DAKO，美国)；四唑盐(M'Iq')(Sigma，美国)；二甲基亚砜(DMSO)(西安化学试剂厂)；DG一3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂)1．2牙周膜成纤维细胞的获得取11—14岁龄因正畸需要拔除的无牙周病、龋病的健康新鲜前磨牙，锐利刀片刮除牙根颈部三分之一牙龈及牙周膜，采用全牙胶原酶消化法培养获得牙周膜成纤维细胞。

　　为成纤维细胞形态，经免疫细胞化学检测，抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性，证实其外胚间充质细胞来源。取第3代细胞用于实验。

　　1．3牙周膜成纤维细胞的诱导

　　1．3．1实验分组对照组：含10ml／L新生牛血清的低糖DMEM培养液；实验组共4组，1组，含25mg／LEMPs、10ml／LFCS的DMEM培养液；2组，含50mg／LEMPs、10ml／LFCS的DMEM培养液；3组，含100mg／LEMPs、10ml／LFCS的DMEM培养液；4组，含10ml／LFCS和200mg／LEMDS的DMEM培养液。

　　1．3．2细胞的诱导取生长良好的第3代PDLCs浓度至2×10／ml。在两块96孔板中，每块板选5列，4O孔，接种细胞悬液100l，标准环境下以1Oml／LFCS的DMEM孵育24h，无血清DMEM培养液静息24h，弃去培养液及未贴壁的PDLCs，按实验分组各孔分别加入液体，对照组为仅含10ml／LFCS的DMEM。每个浓度组设8孔，每孔液量100l。

　　1．3．3OD值的测定标准环境下孵育3d后，取一块板，每孔加入20~Ma-r，继续孵育4h后，吸弃孔内液体，每孔加入150的DMSO，振荡10min，用酶联免疫检测仪在490nm波长下检测OD值，以DMSO作为0对照。结果进行统计学分析，获得3d时各组显效差异。另一块96孔板按实验分组3d换液一次，标准环境培养，到第7d时，按上述方法测各组OD值。结果进行统计学分析，获得7d天时各组显效差异。

　　2结果

　　2．1细胞形态学观察加入诱导因子初期细胞形态无明显变化，随时间延长，实验组细胞逐渐变得突起变短，与对照组相比有明显差异。

　　2．2OD值的测定结果

　　2．2．1EMPs作用于PDLCs3d结果表明，EMPs可以促进人PDLCs增殖(见表1)。EMPs浓度在(5O一200)mg／L时这种促增殖作用呈剂量依赖性。

　　EMPs的最小显效浓度是50mg／L，而200mg／LEMPs的促增殖作用最强。统计分析表明实验组之间：25mg／L与50mg／L无明显差异；25mg／L与(5O一200)mg／L差异显着；(5O一200)mg／L间无明显差异。因此，50mg／L浓度最佳。

　　2．2．2EMPs作用于PDLCs7d结果表明，应用EMPs可促进人PDLCs增殖，与3d结果相似(见表2)。当EMPs浓度在(50~200)mg／L时，这种促增殖作用呈剂量依赖性，结果同前。EMPs的最小显效浓度是50mg／L，而200mg／LEMPs的促增殖作用最强。统计分析表明实验组之间：25mg／L与50mg／L无明显差异；25mg／L与(50—200)mg／L差异显着；(50—200)mg／L间无明显差异；100mg／L与200mg／L间无明显差异。因此，100mg／L浓度最佳。

　　3讨论牙周病治疗的最终目的是牙周组织的再生和形成牙周新附着，而牙周组织再生修复的首要基础是要有一定数量的健康的牙周膜细胞。PDLCs是一组具有多向分化潜能的异质性的多能干细胞，并具有多种表型¨。它包括成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞、间充质细胞等。PDLCs中的未分化间充质细胞可分化为成纤维细胞、成骨细胞或成牙骨质细胞，从而保证其更新换代，使之有足够的能力合成新的牙周组织。PDLCs的这些功能对牙周组织的修复再生十分重要，大部分牙周病晚期病例无法获得理想的牙周组织再生，其主要原因之·就是牙周病损部位参与牙周组织再生细胞的数量和来源不足。目前已证实，多种生长因子能调节牙周膜细胞的生物学活性，刺激牙周膜细胞的增殖，促进牙周组织再生，釉基质蛋白是其中一类。釉基质蛋白是牙胚未矿化釉基质中所含有的蛋白成分的总称，可以与牙周膜细胞表面的整合素样结构结合，促进细胞对牙根面的粘附，通过一定的信号转导途径促进牙周膜细胞的有丝分裂，并使细胞分泌多种生长因子。釉基质蛋白还可以促进某些类型的细胞向成骨方向分化，从而使牙槽骨和牙骨质获得再生。

　　MrI'r比色法主要是一种检测细胞存活和生长的方法。它是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的Mrr还原为难溶性的蓝紫色结晶，沉积于细胞中，而死细胞无此功能，其数量与细胞数量成正比。用DMSO溶解细胞中的紫色结晶物，在490nm波长下检测溶液的吸光度，即可反映活细胞的数量。MTr法利用的正是这样的原理，该方法已广泛地用于一些生物活性因子的活性检测，具有灵敏度高、重复性好、操作简便、客观、经济、快速等优点。所以，MTY法是反映因子对PDLC增殖能力影响的既简便又快速的方法。本实验应用釉基质蛋白作用于体外培养的人牙周膜细胞，观察因子对细胞的增殖效应。实验表明，EMPs在(50—200)mg／L浓度时表现出明显的促进PDLC增殖的能力，而以100mg／L为促增殖效应最佳浓度，这与国外相关报道的结果相符。到目前为止，对EMPs促进PDLC增殖的机理还不清楚。据研究，EMPs中主要活性成份是釉原蛋白，Gesbrelius等的研究排除了釉原蛋白中含有血小板衍化生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)1B，2，3，6，成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子p(TGF—p)、纤维连接蛋白(fiixonectin)、粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM—CSF)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)等细胞因子或生物活性多肽。所以釉原蛋白的生物学涪l生是其本身作用的结果。有人认为，釉原蛋白在中性条件下，自凝聚成不溶的基质，提供了适合细胞生长的空间环境，通过基质一细胞的相互作用导致细胞增殖。也有人试图在PDLC上找寻针对釉原蛋白的特殊受体，但这些尝试还没有什么突破。

　　另外，从本实验还可以看出，同其它一些细胞因子一样，EMPs的PDLC增殖效应也具有饱和性。当EMPs浓度很低时，其效应表现不出来，随浓度提高，其效应也提高，但当浓度提高到一定程度后，如浓度由100mg／L提高到200mg／L，差异不明显，说明只有在合适的浓度，它们的效应才能得以发挥。

　　EMPs对人PDLCs的促增殖作用是它们促进牙周组织再生机理的一个重要组成部分，但牙周组织的再生修复是一个受多因素影响的复杂过程，涉及到一系列有关细胞的迁移、附着和分化等生物学活动，而在此过程中EMPs对以上生物学活动的影响以及与其他生长因子的相互作用等问题，尚有待进一步深入研究。

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