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《中国新药与临床杂志》ERAP 1结构与功能研究进展

　　MHC I型分子对与之高亲和力结合的肽配基长度有严格要求，典型的肽配基长度为8～10个氨基酸残基，因此，被MHCI型分子递呈的肽必须在装载前进行精细剪切。部分抗原经蛋白酶体降解和细胞质氨基肽酶作用即满足要求，另外一些抗原除上述处理外，在内质网中还需进行进一步加工。具有这一活性的肽酶就是一种在内质网中驻留、可由IFN一诱导的金属氨基肽酶，研究者将其命名为ERAP1或ERAAP1 ERAP1综述

　　1．1 基本结构ERAP1是锌金属肽酶M1家族成员之一，该家族包含具有不同特异性和生物学功能的多种氨基肽酶，以可溶性或跨膜蛋白形式存在，GAMEN和HExxHx E序列基序是其结构特征。锌金属肽酶M1家族成员间序列比对显示含有GAMEN和HExxHx E基序的催化结构域序列同源性最强，其次为N一末端部分，高度可变的C．末端螺旋区缺乏同源性。晶体结构研究表明该酶含有4个蛋白结构域。结构域I是一个B一三明治结构域，锚定在嗜热菌蛋白酶结构域的顶部，覆盖其中的活化位点并为底物肽的氨基末端提供了结合位点。结构域II为催化结构域，携带锌原子。结构域III是一个小的B．三明治结构域，位于结构域II和IV之间。结构域IV可变程度最高，其大小从l0个到17个螺旋不等。在ERAP1中，结构域IV由16个大小不等的螺旋组成，以8个反向平行的Armadillo／HEAT型螺旋．转角一螺旋重复结构排列而成，形成一个面向活化位点的凹形表面。结构域IV从活化位点处延伸，形成一个比其他结构更大的腔。

　　1．2 催化位点ERAP1活化位点位于5个二级结构单元的连接处：H2螺旋和邻近的反向平行H3螺旋(携带HExxHx RE基序的HExxH和E残基)，GAMEN环，结构域l环，以及与结构域II～IV交界面毗邻的H5螺旋。在所有M1家族氨基肽酶中，第438位酪氨酸非常保守，在稳定水分子与底物断裂肽键形成的四聚体中问物中发挥重要催化作用，该位点用苯丙氨酸替代可引起酶活性降低190倍。ERAP1结构中有一个大的穴，在携带活化位点的结构域II的凹面表面和结构域Iv螺旋状碗的凹面表面界面形成，可为较大肽提供潜在结合位点。该穴在活化位点附近相对狭窄，而当进人结构域Iv时则变宽，较宽的部分能够容纳与其N一末端区结合的多肽底物C．末端部分。

　　1．3 底物特异性ERAP1中可容纳结合肽侧链N一末端的位点称为剪切位点s1，随后的位置相继被称为S1’，S2’等。

　　S1位点是一个相对狭窄的疏水口袋，与GAMEN环上第316位丝氨酸和第319位蛋氨酸侧链、D1环上的第181位谷氨酰胺和第183位谷氨酸侧链对齐。

　　第一个残基为亮氨酸或甲硫氨酸的肽更适于进入S1口袋，为色氨酸和精氨酸等较大氨基酸时也能形成类似的连接，较小的氨基酸虽可被Sl口袋结构所容纳，但会在结合位点内部留下空缺。因此，氨基末端为亮氨酸和甲硫氨酸残基的肽可被更加有效的加工，而氨基末端为色氨酸、精氨酸和半胱氨酸的肽则不能被有效加工。ERAP2是参与ER抗原加工另一个氨基肽酶，具有和ERAP1不同特异性，对于N一末端为精氨酸和赖氨酸的荧光底物和肽具有优先选择性。二者在s1口袋区显着差异在于第l81位氨基酸的不同，ERAP1在这个位点上氨基酸为谷氨酰胺，而ERAP2则为天冬氨酸。第181位氨基酸形成s1口袋顶部，当谷氨酰胺被天冬氨酸替代后，将使口袋区延伸。第181位谷氨酰胺突变为天冬氨酸后的ERAP1点突变体特异性发生改变，从疏水性氨基酸改变为碱性氨基酸。ERAP1不能剪切由脯氨酸作为第二个氨基酸的肽。ERAP1对其底物N一末端以外其他区域表现出序列特异性。

　　2 ERAP1功能

　　2．1 免疫学相关功能MHC I型结合肽经抗原加工通路产生。内源性蛋白首先在细胞质中经蛋白酶体降解，产生COOH一末端为疏水性或带正电荷的锚定残基片段。

　　大部分片段进一步被细胞质氨基肽酶，三肽基肽酶II、亮氨酸氨基肽酶、博来霉素水解酶和嘌呤霉素敏感性氨肽酶加工，或通过TAP直接定位于内质网腔中。在内质网中，这些肽NH2末端进一步被内质网氨基肽酶剪切，剪切为合适长度后与MHC I型分子结合，并被递呈至细胞表面以利于自然杀伤(natural killer，NK)细胞和特定CD8T细胞的识别。

　　2．1.1 对抗原肽剪切ERAP1可有效剪切长度为9～16个氨基酸的肽，这个长度范围内的肽可被TAP有效转运至内质网中，但对长度为20个氨基酸或更长的肽则无法剪切。

　　ERAP1活性受肽内部残基性质的影响，当肽第二个残基为脯氨酸(x—P．Xn)或长度为8或9个残基时，ERAP1剪切活性降低；而对于COOH一末端为大的疏水性残基肽，则显示出优先剪切活性。基于TAP和MHCI型分子在肽处理过程中的相似性，Chang等提出了ERAP1“分子尺”作用模型，提出其在促进抗原加T和递呈至MHC I型分子中的作用。

　　虽然ERAP1缺乏对大多数MHC1分子的细胞表面表达有一定影响，但用野生型细胞免疫ERAP1 小鼠或反之，则可引起强烈的CD8+T细胞反应，提示ERAP1缺乏不仅从数量上而目从质量上改变了肽．MHC I表达谱P1用一组肽特异性CD8+T细胞杂交瘤在细胞表面展示的单个肽分析表明，ERAPI缺失使得一些肽并未受到影响，而另一些肽或丢失或剧烈上调。与此发现一致的是，对ERAPI缺陷小鼠进行天然和病毒肽加工的质谱分析发现，ERAP1缺失可引起正常情况下被MHC 1型分子递呈肽的长度显着增加。因此，ERAP1的蛋白水解作用决定了内质网中MHC I结合肽的特定长度和组成。

　　2．1．2 细胞因子受体脱落ERAP1可促进几种细胞因子表面受体的剪切。 Cui等证实ERAP1与TNFR1细胞外结构域结合，通过形成TNFR1／ERAP1复合物而促进TNFR1脱落。ERAP1过表达产生可溶性TNFR1，与细胞表面TNF受体竞争，因而当其水平升高可减弱TNF Or．生物活性，当水平降低则募集TNF Or。免疫共沉淀实验表明，ERAP1能够结合但并不能剪切TNFR1。且由于ERAP1不具有肽链内切酶活性，ERAP1催化性突变体的过表达可引起TNFR1脱落增加。可见，虽然ERAP1并不直接催化TNFR1脱落，但可能促进TNFRI脱落酶活性。此外，ERAP1可与IL一6 受体和IL一1II型受体结合并促进这些受体细胞外结构域的脱落。因此，ERAP1被认为在调节先天性和炎症性免疫反应发挥重要作用。

　　2。2 非免疫学相关功能ERAP1和ERAP2通过影响肾素．血管紧张素系统在血压调节中发挥作用。ERAP1可有效将血管紧张素II剪切为血管紧张素III和Iv，而ERAP2则可将血管紧张素IIl剪切为IV。在相同的系统内，两种酶均可将激肽转化为缓激肽{26-271。

　　此外，ERAP1可通过调节细胞增殖和内皮细胞的迁移，调控产后新血管生成。在体外分化实验中，ERAP1可在内皮细胞以及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)刺激后的体内血管发生位点表达。在内皮细胞中，ERAP1表达的抑制可抑制VEGF刺激引起的细胞增殖、体外迁移和血管网络形成以及体内血管生成。在内皮细胞增殖期间，通过与磷脂酰肌醇依赖性激酶1(phosphatidylinositol—dependent kinase 1，PDK1 合，ERAP1可调节VEGF刺激的G／S期转化。通过磷酸化S6K，ERAP1．PDK1一S6激酶复合物引起周期素依赖性激酶(cyclin．dependent kinase，CDK)4／6激活，从而促进G1／S期转化。ERAP1还可通过激活内皮细胞整合素以及局部黏附激酶，增加内皮细胞向细胞外基质的黏附，从而调控内皮细胞伸展。近来研究表明，ERAP1可与一种参与血管生成的核缠绕小体组成蛋白pigpen结合。然而，pigpen与ERAP1如何相互作用从而促进血管生成以及pigpen是否为ERAP1的底物仍不得而知[201。

　　3 ERAP1与疾病ERAP1和ERAP2都是具有高度多态性的基因。天然存在的单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)与若干疾病的发生和进程相关。

　　3．1 高血压Yamamoto等口引发现ERAP1变异体rs30187(K528R)与原发性高血压存在相关性，ERAP1的R528形式比K528形式活性低，其引起高血压的机制在于使缓激肽生成减少和／或血管紧张素II失活降低。这一变异体可使ERAP1将血管紧张素II剪切为血管紧张素III的效率减少60％，将激肽转化为缓激肽的效率降低70％。ERAP1 rs30187变异体在原发性高血压患者的抗高血压治疗中决定了左心室肥大抑制的程度。此外，ERAP1和ERAP2被发现均与一种以高血压和蛋白尿为特征的孕期综合症——先兆子痫相关，在可能发生先兆子痫女陛的前三个月胎盘中，ERAP2表达常发生改变。

　　3．2 细菌和病毒感染ERAP1缺陷小鼠接种鼠弓形体后不能有效产生免疫显性十肽氨基酸HF10，用相应抗原进行刺激，可引起小鼠严重感染甚至死亡，第一次证实ERAP1作为炎症器官一个“易感因素”发挥作用。通过增强或减少CD8 T细胞对特定病毒表位的免疫反应，ERAP1在抗病毒免疫中发挥重要作用。用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(1ymphocytic choriomeningitisvirus，LCMV)感染的ERAP1缺陷型或野生型小鼠，在对特定LCMV肽产生反应的CD8 T细胞分布频率上显示出极大不同。野生型小鼠可对不同LCMV表位产生T细胞反应，接着出现免疫显性，但ERAP1缺陷小鼠则发生显着改变。Draenert等证实，来自人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)表位侧翼区的突变可改变ERAP1介导的抗原加工。而ERAP2可能通过将一种独特的肽谱递呈至CD8T细胞，使其某些变异体对HIV-1感染表现出抗性。

　　研究发现，在人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)对子宫颈上皮的持续感染及其所致的宫颈癌中，ERAP1的几个变异体与肿瘤转移增加和生存率降低相关。近来，ERAP1被鉴定为人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)microRNA miR—US4．1的一个宿主靶点，从而证实了一个以往未知的基于miRNA的免疫逃逸机制。病毒miR．US4—1通过靶向ERAP1干扰MHCI型分子介导的抗原递呈，从而在病毒感染过程中影响许多HCMV来源的抗原肽的生成，最终引起宿主免疫反应中CD8 T细胞对病毒抗原识别缺失所致的免疫逃逸 ”。

　　3．3 自身免疫性疾病GWAS研究证实，ERAP1和ERAP2基因在不同个体对自身免疫性疾病的易感性中及其与特定MHCI型等位基因关联性中发挥重要作用，其中，ERAP1对AS疾病的分子遗传学贡献率为26％，但这一贡献率仅局限于HLA—B27基因型为阳性的AS患者。

　　研究表明，在对肽前体剪切中，与AS具有相关性的ERAP1变异体rs30187(K528)比具有保护性作用的ERAP1变异体具有更快的剪切速率。基于此，研究者提出关于AS病理机制的一种模型，在该模型中，ERAP1可能首先进行异常肽剪切，再由HLA B27进行受损肽的递呈与AS、高血压和溶血性尿毒症等相关的功能性ERAP1变异体(rs30187)也与I型糖尿病和多发性硬化存在相关性。但在糖尿病患者中ERAP1和MHC I基因之间未发现存在关联。ERAP1也是一种新的银屑病易感性基因，与HLA—C*06：02之间存在关联，只有携带HLA—c高危基因的个体ERAP1才影响其对银屑病的易感性。

　　3．4 肿瘤在淋巴和非淋巴性肿瘤中可检测到ERAP1和ERAP2的表达和组织分布。二者在所检测的几乎所有肿瘤细胞系(如黑色素瘤、白血病淋巴瘤、乳腺癌、大肠、肺、绒毛膜、皮肤、前列腺、子宫颈、肾和膀胱)中的表达水平迥异。MHC I型分子表面表达与ERAP1显着相关，但与ERAP2并不相关，提示：ERAP1在产生MHC I型表位中具有支配性作用。此外，肿瘤组织分型不同，两种酶的表达模式也不同。ERAP1和／或ERAP2表达下调主要存在于卵巢、乳腺和肺癌中，而其表达上调则主要存在大肠和甲状腺肿瘤中。ERAPs表达改变可引起MHC I型分子在肿瘤细胞系中异常表达。在大多数浸润型成神经细胞瘤细胞中，ERAP1，ERAP2以及MHC I型分子以极低水平表达。

　　此外，在64％ 子宫内膜癌组织中可检测到ERAP1表达，且这种表达与CA一125水平有关，提示ERAP1在子宫内膜癌细胞生长和分化中发挥作用。

　　在人子宫内膜癌中，ERAP1通过调节血管紧张素II浓度抑制血管再生和子宫内膜细胞迁移。ERAP1变异体与子宫颈癌患者生存率降低有关，ERAP1缺失是对子宫颈癌患者生存率一个独立预测指标，这种作用可能与ERAP1作为MHC I型递呈肽谱的一个关键决定因素有关，提示ERAP1异常表达可能影响机体对免疫监视的逃避。近期研究发现，抑制ERAP1可改变NK细胞活化和抑制信号之间的平衡，并证实通过减少ERAP1表达来干预其自身活性能够在体内增加肿瘤免疫原性，这可能代表了一种抗肿瘤治疗新途径

　　4 小结与展望毋庸置疑，ERAP1结构和功能特征决定了其在炎症、自身免疫性疾病、肿瘤等病理条件下发挥着独特作用。但ERAP1究竟如何精确影响相应疾病的发生发展并不清楚，未来只有进一步提供这些研究数据，才可能加深我们对ERAP1作用和意义的理解，深化对相关疾病本质的认识，最终为疾病的诊断和治疗提供有益的指导。

　　本文节选自《中国新药与临床杂志》的医学论文，感谢你的阅读！

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