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《中国感染与化疗杂志》产超广谱β内酰胺酶大肠埃希菌耐药特征及基因

　　分型大肠埃希菌为临床常见病原菌之一，随着抗菌药物大量、广泛的应用，其耐药现象日趋严重。产超广谱β内酰胺酶(ESBLs) 大肠埃希菌对 内酰胺类抗生素耐药的主要机制，它可使细菌对青霉素类、单环内酰胺类抗生素及第一至第三代头孢菌素耐药。由于ESBLs的基因型较为复杂，各基因型对抗菌药物的敏感性有所差异，同时大肠埃希菌所产ESBLs表达的基因型，其流行状况随时间及地点的不同而有所不同，对临床治疗感染的效果产生影响。

　　因此检测大肠埃希菌中产ESBLs菌株的耐药特征及基因型，对于临床合理应用抗菌药物及流行病学的调查具有重要意义。

　　材料与方法

　　一、材料

　　(一)菌株83株大肠埃希菌分离自山东中医药大学附属医院2011年6—12月I临床标本，同一患者同一部位仅用第1次分离标本菌株。标准菌株由山东省临床检验中心馈赠。

　　(二)培养基及药敏试验纸片 MH培养基和药敏试验纸片为英国0xOID公司产品。

　　(三)试剂 鉴定系统为英国Trek DiagnosticSystem LTD产品。PCR 引物由博尚生物公司合成，反应体系为大连宝生物有限公司产品。

　　(四)主要仪器 细菌鉴定仪为SENSITITRE荧光法全自动快速微生物鉴定仪Aris(英国TrekDiagnostic System LTD产品)；PCR扩增仪为7300Real Time PCR System；电泳仪为DYY一2C型、凝胶成像分析仪为GDS一8000。DNA测序为AB1377型自动测评仪。

　　二、方法

　　(一)药敏试验和ESBLs表型确证试验 采用CLSI 2011年版推荐的纸片扩散法(K—B)进行药敏试验及采用双纸片确证法。

　　(二)PCR模板制备 挑纯培养菌落置人0．5mL离心管内(内预置200 ng／mL蛋白酶K溶液200L)，95℃ 水浴10 min，离心(15 000 r／rain)30 S。上清液即为基因检测的模板液，一2O°C冰箱保存备用。反应体系、反应条件、引物序列见参考文献。

　　(三)PCR产物测序 将TEM 型和SHV型扩增产物进行测序，DNA测序采用sanger末端终止法，用AB1377型自动测序仪进行双向测序，结果经DNAssist软件处理后在GenBank网上查询。

　　(四)药敏试验数据分析 采用WHO 推荐的WHONET 5．6软件对数据进行统计分析。

　　结 果

　　一、大肠埃希菌产ESBLs检测及药敏试验结果83株大肠埃希菌中，45株ESBLs表型确证试验阳性，检出率为54．2%，产与非产ESBLs株对常用抗菌药物耐药性。

　　二、大肠埃希菌PCR扩增检测基因分型83株大肠埃希菌，经PCR扩增检测，CTX—M型阳性44株，TEM 型阳性32株，SHV 型阳性1株，其中CTX—M 型+TEM 型阳性11株。各基因型所占比率依次为CTX—M 型53．0%、TEM 型38．6%、SHV型1．2%。CTX—M 型+TEM 型阳性在基因分布中占16．7%。

　　三、DNA序列分析TEM 型和SHV型的扩增产物序列分析，结果分别为广谱酶TEM一1和SHV一1型。

　　产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌讨 论大肠埃希菌为临床常见的病原菌之一。2010年CHINET资料表明，大肠埃希菌在肠杆菌科细菌临床分离菌中居首位，占26．9%。大肠埃希菌也是产ESBLs主要菌种之一。本研究显示大肠埃希菌中ESBLs检出率为54．2%，与国内CHINET监测数据56．2%相近，但高于国外报道的4．9%～48．5%

　　大肠埃希菌对I3内酰胺类抗生素的主要耐药机制为产β内酰胺酶，其中广谱 内酰胺酶和ESBLs的基因流行得到了广泛的关注，在不同国家、不同医院大肠埃希菌基因型及亚型流行各有特点，所占比率不尽相同，其中CTX—M 型、TEM 型、SHV型报道频率最高。据国外近年报道，CTX—M 型在基因分型中趋于主要地位，为88．57%～70．9% ，其中波兰报道占首位，法国次之，为76%，西班牙报道为72％ ，加拿大研究表明为70．9%；我国报道CTX—M 型所占比率差别较大，为93．6%～35．5%，显示不同地区基因流行特点不同，本研究CTX—M型所占比率为53．0%与天津地区数据(67．9％)相近，高于宁夏地区(35．5%)的数据，低于深圳、佳木斯及合肥地区报道(分别为93．6%、93．1%、90．2%)。国外报道TEM 型所占比率多低于同一研究中SHV型比率，前者范围在2．86 ～1.2%，后者在26．8%～3．6%，而国内报道则不同，TEM范围为86．3%～ 59．6%，SHV 为27．9%～3．45%。本研究TEM型及SHV型为广谱B内酰胺酶，所占比率为38．6%和1．2%，与国内报道数据相比处于较低水平。此结果体现出本院大肠埃希菌耐药基因流行的特点。本研究结果显示，同时携带CTX—M 和TEM 两种β内酰胺酶的菌株占16．7%，从基因水平显示了产ESBLs病原菌耐药基因的复杂性。由于大肠埃希菌的耐药基因尤其是ES—BLs基因，具有复杂性和多样化特点，且有区域性流行，因而各地有必要对本地区进行监测，为预防、控制和治疗提供依据。

　　产ESBLs菌株可能同时携带其他耐药酶，如AmpC酶，此酶特点是水解头孢菌素的能力大于水解青霉素类，且可水解头霉素，但不被克拉维酸、他唑巴坦及EDTA所抑制，故在ESBLs表型确证试验中，这些菌株双纸片的抑菌环差异偏小甚至无差异，从而出现表型确证试验阴性而PCR扩增阳性结果；同样表型检测ESBLs阳性菌株，由于可能存在其他超广谱8内酰胺酶基因型或新基因，或引物匹配区域序列问发生基因某种突变，造成表型确证试验阳性而PCR检测结果阴性，因此在调查ESBLs菌株时，表型确证与PCR方法相结合，可为进一步研究奠定基础。

　　大肠埃希菌所携带ESBLs质粒可以通过接合、转化、转导、整合等形式在同种或异种细菌间传播，并与其他耐药基因融合，故产ESBLs细菌不仅对青霉素类、头孢菌素类抗生素耐药，而且对氟喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类等抗菌药物存在多重耐药现象，从而造成严重的医院内交叉感染。本试验结果表明，产ESBLs大肠埃希菌对替卡西林、哌拉西林、头孢唑林、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南耐药严重，耐药率皆高于9O%，而对头孢吡肟和头孢他啶耐药率为53．4%和64．5%。产ESBLs大肠埃希菌对环丙沙星和左氧氟沙星耐药率为68．9 %和73．3%，此除细菌对其作用的靶位拓扑异构酶改变外，可能与细菌质粒介导qnr耐药基因的转移相关。同为氨基糖苷类抗生素，实验菌株对阿米卡星和庆大霉素的耐药状况截然不同，对前者耐药率为13．3%，后者却为75．6%，证明了阿米卡星对钝化酶的稳定性强于庆大霉素。在酶抑制剂复合制剂药物中，头孢哌酮一舒巴坦的耐药率高于哌拉西林一他唑巴坦，各为48．9%和17．8%，此可能与前者在我院临床应用较广泛相关。头孢西丁作为头霉素类抗菌药物，产ESBLs菌株对其耐药率为31．1%。尽管近年来，大肠埃希菌对碳青霉烯类抗生素不敏感报道不断出现，但本研究未见对亚胺培南及美罗培南耐药的菌株。

　　本次调查的大肠埃希菌非产ESBLs菌株，对青霉素类耐药率虽低于产ESBLs菌株，但已达68．5%，同时菌株对甲氧苄啶一磺胺甲口恶唑的耐药率大于5O%，因此不推荐用上述药物作为经验治疗用药。非产ESBLs大肠埃希菌对氨曲南及头孢菌素类药物耐药率均低于30%，临床上可考虑优先选用。

　　总之，大肠埃希菌对临床常用抗菌药物耐药较为严重；定期监测该菌的耐药性变迁，从而采取针对性防控措施，对减少耐药菌的出现和播散，指导临床合理使用抗菌药物，具有重要意义。

　　本文节选自《中国感染与化疗杂志》的医学论文，感谢你的阅读！

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