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《哈尔滨医科大学学报》骨髓微血管密度和血管内皮细胞生长因子在多发性骨髓瘤患者中的表达及意义

　　多发性骨髓瘤(MM)是B细胞来源的浆细胞恶性血液肿瘤，其发病机制尚不清楚，目前还不能完全治愈。近年来研究认为，血管新生在MM 发病机制中起重要作用，MM 的发生、发展依赖于新生的肿瘤血管网。有研究报道，血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体是目前已知作用最强、特异性最高的血管新生正性调控因子，VEGF具有刺激内皮细胞分裂、增生、促进内皮细胞移行，增强血管渗透性等生物学效应，在恶性血液系统疾病中起着重要的作用。骨髓瘤细胞可以产生VEGF而促进血管新生作用，血管新生为MM细胞的生长创造了有利的微环境，MM 患者骨髓血管新生明显增高。反应血管新生最常用的一项指标是微血管密度(MVD)检测，而骨髓MVD 的测定方法简单易行。本研究中，我们通过检测MM 患者骨髓MVD及VECF表达水平，探讨其在治疗前后的变化、与瘤负荷的相关性，探讨其与MM 发生、发展之间的作用，为MM 患者瘤负荷的判断及短期疗效的判断提供理论依据。

　　1 资料与方法

　　1．1 研究对象：2009年9月至2012年8月在本院初诊并治疗的MM 患者44例作为观察组，其中男26例，女18例，年龄43～81岁，中位年龄59岁。所有诊断与临床分期及疗效评估均符合《血液病诊断及疗效标准》(第3版)。按疾病临床分期(ISS)标准：I期6例，Ⅱ期13例，Ⅲ 期25例。44例初诊患者住院采用T—VAD或BDT、MP方案化疗，6个疗程后进行疗效评估判断。其中缓解组34例，男2O例，女14例，年龄43～78岁，中位年龄58岁；未缓解组1O例，男6例，女4例，年龄47-81岁，中位年龄62岁。另选外周血一系非特异性降低或升高患者3O例作为对照组。其中男16例，女14例，年龄21～52岁，中位年龄4O岁。均排除恶性肿瘤、血液系统疾病及结缔组织病。骨髓涂片瑞氏染色及骨髓活检苏木精姬姆莎一酸性品红(HGF)染色证实为正常骨髓象，取材前未应用过糖皮质激素及细胞毒类药物。

　　1.2 标本采集与处理：MM 患者初诊未治及经6个疗程后，分别行常规消毒髂后上棘局麻后行二步法骨髓抽吸一活检取材，置骨髓活组织于一80℃ 丙酮液固定，用改良的GMA塑料包埋制成3～5m 厚的骨髓组织病理切片。

　　1．3 主要试剂及实验方法：免疫组织化学试剂购自福建迈新生物技术公司。用抗CD。 抗体标记骨髓血管内皮细胞，抗VEGF抗体标记骨髓VEGF表达的标记抗原；以3，3-二氨基联苯胺DAB显色；EnVision羊抗兔和羊抗鼠二抗即用型。

　　免疫组织化学染色二步法检测步骤按照试剂盒说明书进行。

　　1．4 骨髓MVD计数：微血管判定和计数方法参照文献[4]。

　　任何呈棕黄色阳性的内皮细胞或内皮细胞簇，且与邻近血管和骨小梁清楚分开者为1个能够计数的血管，连续染色没有中断的区域即可视为一个血管，不一定存在管腔；大血管及骨膜与骨中的血管不计数在内。用1O×1O倍显微镜头观察整个切片，确定3个热点(hot spots，即微小血管密集的区域)，再以4O×1O倍目镜头计数每个热点的微血管数，取其平均值来表示MVD。

　　1．5 VEGF评分：参照文献采用VEGF表达阳性判断和分级、计数评分方法。VEGF显色主要定位于细胞的胞浆，部分细胞膜可见显色，阳性为棕黄色或棕褐色。采用半定量计数方法，按VEGF染色强弱及阳性细胞的所占比例两个方面来评定VEGF表达。根据细胞的染色强度分为5个等级：

　　1级，阴性或微弱染色；2级，％50 阳性细胞中等强度染色；3级，>5O 阳性细胞中等强度染色；4级，< 50 阳性细胞高强度染色；5级，>5O 阳性细胞高强度染色。根据阳性细胞所占的比例分为3个等级：1级，< 1O 阳性细胞；2级，1O ～5O 阳性细胞；3级，>5O 阳性细胞。取3个光镜高倍镜视野造血细胞染色强度的等级平均值与阳性细胞比例等级数相乘，结果用任意单位(arbitrary units，Au)值表示。

　　1．6 统计学方法：采用SPSS17．0软件进行数据处理。计量资料用 ±S表示，组间比较采用成组设计资料两样本均数的t检验，多样本资料的比较用方差分析，相关性分析采用非参数Spearman检验。P< O．05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2．1 MM 患者观察组与对照组骨髓MVD及VEGF表达：

　　MM 患者组中VEGF显色主要定位于骨髓瘤细胞的胞浆，部分瘤细胞膜可见显色，阳性为棕黄色或棕褐色；对照组中VEGF仅在血管内皮细胞中可见阳性表达，正常浆细胞未见VEGF阳性表达。MM 患者检测骨髓中VEGF呈高阳性表达，观察组中VEGF阳性者有27例，占61．36 ；观察组中MVD和VEGF表达明显高于对照组(t一9．822，P 一0．000；t一8．164，P一0．005)，见表2．3 观察组MVD及VEGF表达与临床分期的关系：发现ISS分期为Ⅲ 期MM 患者(25例)的骨髓MVD、VEGF明显高于I期和Ⅱ期患者(19例)(t一20．45，t一16．84，均P<0．01)，见表3。

　　2．4 观察组MVD及VEGF的相关性：在44例MM 患者中，观察组VEGF 阳性者有27例，占61．36 ，MVD 及VEGF两者表达共同阳性26例，共同阴性7例。经Y 检验，观察组中VEGF、MVD两者阳性之间无明显差异(Y 一2．738，P一0．096)，但经相关分析，发现两者阳性呈正相关(r一0．581，P<O．01)。

　　3 讨 论骨髓血管新生在各种恶性血液系统疾病发生发展中的作用日益受到重视，研究证实多数恶性血液系统疾病骨髓MVD及VEGF明显增加。骨髓血管新生与MM 患者的疾病进展密切相关，其为瘤细胞的生长创造有利的微环境，随病情的加重骨髓血管新生的程度明显加重lE]。VEGF是一种肝素结合的血管生成因子，是已知作用最强的血管新生正性调控因子，主要由肿瘤细胞及骨髓问质细胞分泌，通过血管内皮细胞表面的两个受体fit21和flk21的结合刺激内皮细胞的增殖，增加微血管的通透性，促进肿瘤微血管生成等多种功能，从而导致骨髓MVD增高，为肿瘤快速增殖和转移提供条件。实验结果显示，初诊MM 患者骨髓中VEGF和MVD呈高表达，并呈正相关一致，这与国内外学者报道一致。这进一步说明VEGF通过促进血管新生而在MM 发病机制中可能扮演重要作用。治疗前MM 患者组较对照组骨髓VEGF表达MVD及明显增高(P>0．01)，而且治疗后缓解组骨髓MVD及VEGF较治疗前有明显下降(P<0．01，P<0．05)，未缓解组则下降不明显(P< 0．05)。缓解组患者骨髓血管形态与对照组骨髓近似，而未缓解组则仍见病理性血管新生明显。这些均说明骨髓MVD及VEGF能反映MM 患者的近期疗效。有效的化疗抑制瘤细胞的增殖，从而抑制瘤细胞表达VEGF，抑制骨髓血管新生；而未缓解组则瘤细胞仍反复表达VEGF，VEGF通过自分泌和旁分泌刺激骨髓血管新生，导致MVD增高。

　　本研究发现骨髓血管再生程度与骨髓瘤细胞的增生活性高度相关，初诊未治的MM 患者骨髓MVD及VEGF表达明显相关，活动期骨髓MVD及VEGF表达明显高于非活动期患者，肿瘤负荷高的MM 患者骨髓MVD及VEGF表达明显高于肿瘤负荷低的患者，与Stachel等l6 报道基本一致。

　　Ⅲ期患者组骨髓MVD及VEGF表达最高，提示VEGF的表达可能赋予肿瘤细胞较强的增殖能力，与MM 疾病进展有关。这说明骨髓MVD及VEGF表达可间接反应肿瘤负荷、临床分期水平，与疾病严重程度平行 。

　　综上所述，血管新生在MM 的发生和转移中有着密切的关系，骨髓MVD及VEGF表达水平可作为MM 患者临床分期、疗效监测和预后判断的辅助指标。通过抑制血管新生、中断肿瘤营养供给达到治疗目的，抗血管新生治疗与化疗的联合应用逐渐成为治疗MM新的有效途径。目前，沙利度胺、硼替佐米等血管生成抑制剂药物已在临床广泛应用，其抗血管新生作用已被广泛证实。这也提高了对肿瘤发生及发展过程中血管生成的认识。以血管新生为靶点，通过现代分子生物学和遗传学等技术方法，在基因及细胞分子水平对其表达、活性及其效应等多个环节进行有效抑制而达到治疗MM 的目的，为应用血管生成抑制剂与其他化学药物联合应用治疗MM 提供了新的治疗策略。

　　本文节选自《哈尔滨医科大学学报》的医学论文，感谢你的阅读！

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