血小板聚集实验的检测，临床上主要用于药物的疗效观察，以防止血栓的形成，是一个重要的评价抗血小板聚集药物的实验。SD大鼠血小板聚集实验的测定方法少见报道，主要是因为SD大鼠的血液学指标与人不一样。目前临床上的血小板聚集实验的检测是根据人的血液来设计的，对于SD大鼠就完全不适合。因此，建立SD大鼠血小板聚集实验的测定方法，可以用于抗血小板聚集药物的筛选，以及中药活血化瘀药物的评价医学院动物室，合格证号：JZDW No：2013—0024，硅化抗凝管，3．8%枸椽酸钠，二磷酸腺苷(ADP)，购于北京世帝公司。

 

　　1．2 仪器北京世帝血小板聚集仪。

 

　　2 实验方法

 

　　2．1 SD大鼠的取血方法股动脉取血，然后准确吸取2 mL，放人抗凝管中。

 

　　2．2 抗凝剂量的选择由于SD大鼠血液的抗凝能力强于人的抗凝能力，所以，用人的抗凝管(9：1)抽SD大鼠血液样本会凝固，因此，操作者依次从0．20 mL递加抗凝剂并轻轻摇动，直至血液放置30 min后不会凝固为止，结果见表1。根据表1的结果，本实验选择1．65 mL血液、0．35 mL抗凝剂的比例。

 

　　2．3 离心速度的选择分别取SD 大鼠血2．0mL，分别以800r·min，1000 r·min，1 200 r·min，离心10min，观察离心后的血液上层血浆，即不含红细胞，血浆也不能太清亮，离心速度太高，大部分血小板下沉，血小板数量太少，不利于检测。

 

　　根据表2提示，离心速度选择1000 r·min。，离心10 min

 

　　2．4 血小板浓度的调整由于SD大鼠的血小板范围在(600～1 000)×10/L，大大高于人的血小板数，血小板检测仪器根据人的血小板数来检测的，因此需用自身血浆调整血小板数至150×10/L 左右。

 

　　2．5 血小板聚集率测试原理：在特定的连续搅拌条件下，于富含血小板血浆(PRP)中加入诱导剂(ADP)时，由于血小板发生聚集，悬液的浊度就会发生相应的改变，光电池将浊度的变化转换为电讯号的变化，在记录仪上予以记录。根据描记曲线即可计算出血小板聚集的程度和速度 。

 

　　LG—PABER血小板聚集仪，操作如下：1)将200L对照血浆加入测试杯中，放入测试通道，按(PPP)键，屏幕进入PPP状态，进行采样后取出。

 

　　2)将200 L乏血小板血浆PPP加入测试杯中，再加入测试珠，将测试杯移入测试通道，37℃ 预温1 min后启动仪器。3)立即用加样器吸取诱聚剂ADP 20 L(室温放置)插入到杯底将试剂加入，进行自动测试并记录结果。

 

　　2．6 检测方法的稳定性取同一SD大鼠的血液，按上述方法制备血小板，分别在3O、60、100 min测定血小板5 min最大聚集率，其聚集率的变异系数(RSD)为3．34 (<5)。聚集率均数(X)为56．53，标准偏差(S)为1．890，相对标准偏差RSD(变异系数)为3．34 (<5)，表明此方法在100 min内测定结果基本稳定。

 

　　2．7 检测方法的重复性取同一SD大鼠的血液样本4份，按上述方法，检测大鼠血小板5 min最大聚集率。见表4。聚集率均数(x)为61．25，标准偏差(S)为1．5864，相对标准偏差RSD(变异系数)为2．59 (<5 )，表明4份平行样本的检测结果变化不大，此方法的重复性良好。

 

　　3 结果根据上述方法，分别测定50只SD大鼠血小板5 min最大聚集率95 的可信区间，范围为52 ～76％ 。

 

　　4 讨论本实验在操作时应注意：1)采血速度要快，避免产生溶血，避免混入组织液，及时混匀。2)标本采集后，及时检测。3)采好的标本要加盖，避免pH值发生变化，影响结果。4)血小板聚集实验的血小板数为150×10。L 左右。5)测试杯最好为新杯。

 

　　血小板聚集实验不仅有着重要的临床意义，在抗血小板聚集药物的研发方面也有着重要意义。抗血小板聚集药物又称血小板功能抑制剂，随着对血栓性疾病发生机制的认识，抗血小板治疗在临床中的地位愈来愈重要，新的血小板功能抑制剂不断涌现，抗血小板聚集药物在血栓性疾病中得到广泛应用，因此，大鼠的抗血小板聚集实验方法的建立，为2．5．7 回收率试验取丹皮酚对照品适量，分别配置成高(4．8g·mL )、中(3．2 g·mL)、低(1．5 g·mL )3个浓度的样品液，每个质量浓度平行制备3份，在上述色谱条件下进行测定，按“2．5．2”项求得的标准曲线方程计算药物浓度，以所测浓度与实际浓度比较，求得高、中、低3个质量浓度的平均回收率分别为95．3%、97．1%、94．2%，96．4%、96．8%、95．1%，96．1%、97．3%、95．5%，平均值为95．5%，RSD—1．53 ，符合要求。

 

　　2．5．8 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样1O L，记录色谱图，计算RSD 值。结果显示：RSD一0．75%，表明该药物在8 h内稳定。

 

　　2．6 不同提取方法的含量测定取“2．3”项不同提取方法所制备的供试品溶液平行3份分另0进样1OL，记录色谱图，计算丹皮酚含量，结果显示超声提取法的提取效率最高。

 

　　3 讨论赤芍药材中的主要有效成分为芍药苷，而定量分析丹皮酚可达到综合控制赤芍药材质量的目的。

 

　　本研究建立了HPLC测定赤芍中丹皮酚含量的方法。经方法学考察得知本法具有分析灵敏度高、专属性强、回收率和精密度高以及稳定性好等优点，适合于测定丹皮酚含量的研究分析。另外，本实验结果还显示，不同的提取方法对赤芍药材中丹皮酚含量测定有明显的影响，其中以超声提取法的提取效率最高，而浸渍法的效率最低，其原因可能是因为丹皮酚不耐高温，其使用加热回流法和索氏提取法在提取过程中破坏和损耗较高，因而提取效率较低，而浸渍法不但溶剂消耗量大，而且费时长，也不能满足大生产的需要。本研究对丹皮酚的不同提取法进行了探讨，对优化提取工艺具有一定的指导作用，值得应用于大生产中。

 

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