肠道病毒(enteroviruses，EV)归类于小RNA病毒科肠道病毒属，是引起人类感染最常见的病毒之一。根据2012年7月国际病毒分类委员会最新修订，肠道病毒属主要分为肠道病毒A、B、C、D、E?F G 及H 组。肠道病毒基因组为单股正链RNA，约7．5kb，两端为保守的非编码区，中间为连续开放读码框，编码一个多聚蛋白(polyprotein)。

 

　　多聚蛋白经酶切后形成P1、P2及P3前体蛋白，P1前体蛋白经一系列加工后，形成结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；P2、P3前体蛋白被切割形成非结构蛋白2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D。

 

　　虽然病毒的非结构蛋白不是病毒二十面体结构的构成部分，但在病毒增殖及宿主致病过程中发挥着重要的作用，本文就肠道病毒非结构蛋白功能的研究进展进行综述。

 

　　1 2A蛋白肠道病毒2A蛋白含有150个氨基酸，是一种半胱氨酸酶。一方面，2A蛋白催化病毒前体蛋白P1与P2之间的肽键断裂，对多聚蛋白进行初级加工。另一方面，2A蛋白能够抑制宿主蛋白的表达，参与病毒的复制和翻译，维持病毒RNA的稳定性。

 

　　新型肠道病毒71型(enteroviruses type 71，EV71)编码的2A蛋白能够分解多种宿主蛋白，包括真核起始因子4G(eukaryotictrans1ation initiation{actor4G，elF4G)和DNA 修复酶PARP[-poly(ADP—ribose)polymerase]。EV71 2A 蛋白通过切割elF4G1，诱导细胞凋亡、破坏翻译起始复合体的形成及抑制与宿主细胞生理活动相关蛋白因子蛋白激酶PKR的合成。Morrison等 用脊髓灰质炎病毒1、2、3型(poliovirus 1、2、3，PV1、2、3)、新型肠道病毒70型(enteroviruses type 70，EV70)、人鼻病毒16型(human rhinovirus type 16，HRV16)及心病毒属中的脑心肌炎病毒感染经IFN—n处理后的HeLa细胞，结果发现这些肠道病毒在IFN—a处理的细胞中可正常复制，而脑心肌炎病毒却无法复制。

 

　　在进一步对PV 2A蛋白上的氨基酸进行突变后，发现PV不能正常增殖；而将PV 2A基因克隆入脑心肌炎病毒后，脑心肌炎病毒也能在a干扰素处理的细胞中复制。这些结果表明PV 2A蛋白可以抑制干扰素刺激基因的抗病毒活性，并且能够下调干扰素传导信号。近期研究也发现在EV71感染的细胞中，2A蛋白能够通过水解线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，M AVS)进一步抑制工型IFN的抗病毒活性。此外，Yang等发现EV71 2A蛋白在酵母细胞中表现出很强的转录活性，其C一端的酸性结构域是转录活性所必需的，也是病毒RNA复制不可或缺的，而改变2A蛋白C一端的氨基酸后这种转录活性消失。同样，柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3，CVB3)的2A蛋白的C一末端也有这种转录活性控制区域，因此2A蛋白的C一末端是决定转录激活性质的区域。

 

　　不同种肠道病毒2A蛋白对宿主细胞也能产生相反的作用，例如PV 2A蛋白可激活宿主细胞基因PCBP2、PTBP1、RTN3、GBF1、CD55和SAM68，这些基因有利于病毒的复制；但EV71 2A蛋白不仅未起到激活作用，反而抑制了这些基因的表达；CVB感染的小鼠模型中，过量表达的2A蛋白导致严重的心肌功能障碍和扩张型心肌病。

 

　　2 2B蛋白肠道病毒2B蛋白约由100个氨基酸组成，主要包括2个结构域，其中一个为N一端富含碱性氨基酸的两亲螺旋，由32～55个氨基酸组成；另一个为跨膜结构域(transmembrane domain，TMD)。这些结构特点使2B蛋白具有增强宿主细胞膜通透性，促进病毒复制的功能。2B蛋白提高宿主细胞内膜的通透性之后，由于细胞外Ca流入，细胞质内游离的Ca计浓度逐渐增加，进一步导致细胞内Ca失衡，最终促进子代病毒的释放。EV71 2B蛋白与髓样细胞白血病一1(myeloid cell leukemia-1，Mcl一1)之间的相互作用，2B蛋白能够影响Mcl一1的泛素化，调控Mcl一1的表达，而Mcl一1的增加导致细胞凋亡减少。此外，PV 2B蛋白在COS一1细胞中的表达能够抑制宿主蛋白的分泌。

 

　　3 2C蛋白肠道病毒2C蛋白由329个氨基酸组成，具有宿主细胞膜重排、基因组复制和病毒部分脱壳。的功能。肠道病毒2C蛋白第5—43位的氨基酸具有潜在的膜结合活性，能够结合、重排宿主细胞的膜蛋白，参与形成病毒复制复合体。脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒A20(coxsackievirus A20，CAV20)的2C蛋白是病毒复制复合体的必要组成部分，与病毒的衣壳蛋白具有特殊的亲和性。例如PV 和CAV20 2C蛋白与结构蛋白VP3有直接的相互作用，这种相互作用对病毒形态的形成具有重要作用。Tang等研究发现内质网膜蛋白3(retieu-Ion 3，RTN3)首先与EV712C蛋白作用，然后结合病毒dsRNA 进而形成病毒复制复合体。通过对EV71编码的第25位异亮氨酸突变分析研究，证实了病毒通过2C蛋白N一端的膜结合区与RTN3的内质网蛋白同源区(reticulon homology domain，RHD)产生相互作用。Sun等 在人肠道病毒85型(human enterovirus 85，HEV85)温度敏感实验中发现，36℃条件下几乎不影响病毒的毒力，但在39．5℃条件下降低了病毒在体外复制的能力，而2C蛋白第4102位和第4256位核苷酸成为HEV85温度敏感实验中的决定性位点。

 

　　4 3A蛋白肠道病毒3A蛋白由87～89个氨基酸组成，是参与形成病毒复制复合体的骨架蛋白。3A蛋白的C一端包含一个疏水域，对病毒的复制具有重要作用；N一端包含一个富含脯氨酸的结构域。一方面，N一端结构域抑制内质网至高尔基体的顺序转运。Wessels等 通过对CVB3 3A蛋白的突变研究，证明了完整的脯氨酸结构域对CVB3 3A蛋白抑制内质网至高尔基体顺序转运是必不可少的。此外，CVB3 3A蛋白的表达还能分解高尔基体口 。对CVB3 3A 的疏水端进行突变后(V45A，I54F，H57Y)，病毒能够抵抗TTP一8307对病毒复制的复合物的抑制作用。3A蛋白在病毒感染过程中抑制宿主细胞蛋白的分泌和从内质网至高尔基体的顺序转运，从而降低p干扰素(interferon— )、IL一6、IL～8和被感染细胞膜上的MHC 工抗原和TNF受体的表达。另一方面，N一端结构域作为“黏附壁”，使3A蛋白快速的与许多具有疏水域的蛋白相结合，例如其能够与RNA PolII结合，形成RNAPol 1I前体起始复合物，起始基因的表达。肠道病毒的复制依赖三型肌醇磷脂4位激酶0(phosphati—dylinositol 4-kinase class Il beta PI4KⅢG)，通过降低PI4KIll J3的活性可以减少病毒复制。3A 蛋白与PI4KUI口结合形成复合物，同时和ACBD3[golgiadaptor acyl coenzyme A (acyl—CoA )binding do—main protein 3]相互作用，当3A 蛋白不存在时，ACBD3又能够与PI4K HI J3结合形成复合物。采用RNA干扰技术将ACBD3进行“沉默”，病毒的复制受到抑制，说明破坏3A／ACBD3／PI4K Ill B复合物可以抑制PI4KⅢ．9的活性，这为肠道病毒的治疗提供了新的线索。

 

　　5 3B蛋白肠道病毒3B蛋白也称为VPg，分子质量小，仅由22个氨基酸组成，氨基酸为碱性，含有部分疏水结构。3B蛋白通过磷酸二酯键将自身第三位酪氨酸(Y3)共价结合于病毒RNA的5端，其Y3绝对保守，它是VPg尿苷酸化和病毒负链RNA复制必需的功能氨基酸；VPg被3D聚合酶催化尿苷酸化后作为病毒RNA合成的引物。

 

　　6 3C蛋白肠道病毒3C蛋白由183个氨基酸组成，集丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶特性为一体，作为丝氨酸蛋白酶，3C蛋白催化病毒前体蛋白裂解，形成成熟的结构蛋白和非结构蛋白，抑制其催化功能可有效抑制病毒前体蛋白的切割，阻断病毒复制，是病毒药物治疗研究的靶点之一。肠道病毒3C蛋白的催化活性位点为H40、G71和C147，专一性切割谷氨酰胺一甘氨酸位点。EV71 3C蛋白的G一折叠是一种新的开放式构象，其底部是2个铰链区稳固的B一折叠构象，即使3c蛋白的其他部分构象改变后，折叠区仍然稳固。

 

　　作为半胱氨酸蛋白酶，肠道病毒3C蛋白不仅能够分解感染细胞中的poly’A 结合蛋白(poly’Abinding protein，PABP)，而且分解eIF4G、eIF4B和终止因子eRF3结合的c一端。de Breyne等 发现PV和CVB3感染的细胞中，3C蛋白在一个单独的位点分解eIF5B，体外研究发现其对elF1、eIF1A、eIF4B、elF4F和eIF5没有分解作用，这说明3C蛋白调节分解过程具有特异性。PV 3C蛋白可裂解TATA一盒结合蛋白(TATA—binding protein，TBP)、转录因子CREB、Oct一1及p53导致细胞转录活性降低，最终抑制RNA Pol II介导的细胞起始转录。在感染的细胞内，PV 3C蛋白蛋白酶可抑制a—IFN、ISG-54(IFN刺激基因54)、ISG一56(IFN刺激基因56)和肿瘤坏死因子 的表达。此外，CVB、EV71等其他肠道病毒3C蛋白可抑制病毒引起的G—IFN和维甲酸诱导基因I(Retinoid Acid—induciblegene，RIG—I)的表达，动物细胞表达的肠道病毒3C蛋白与RIG—I的半胱天冬酶募集区结合，可阻碍RIG—I与IPS—I的结合以及后继IFN调节因子3的核转移和J3干扰素激活 。近期研究 报道，新发现的人肠道病毒93感染细胞后，抗人鼻病毒复合物AG7404和AG7088能够抑制病毒3C蛋白的蛋白水解活性。

 

　　3C蛋白是肠道病毒复制所必需的蛋白，具有RNA结合活性，其中第82—86位的“KFRDI”和第154—156位的“VGK”是RNA 的结合区。研究发现3C蛋白与RNA 结合位置上序列的改变会影响3C蛋白活性，而催化位置上的突变，却不会改变3C蛋白的RNA结合能力。利用pEV71感染性克隆在KFK1序列与VGK序列突变型的转录体，探讨RNA结合能力对病毒复制的影响，发现具有RNA结合能力的3C蛋白突变型亦能够合成负链RNA，表明3C蛋白的RNA结合能力与病毒RNA的复制有着密切的关系。

 

　　非结构蛋白3c和2A是肠道病毒在宿主细胞内完成复制的基础，具有不同于肠道病毒其他成员的结构和作用机制。2A蛋白对多聚蛋白进行初级加工，3C蛋白则完成对多聚蛋白的次级加工。肠道病毒蛋白3C和2A可以水解大量宿主蛋白，对维持病毒结构、蛋白翻译和转录具有重要作用。

 

　　7 3D蛋白肠道病毒3D蛋白由462个氨基酸组成，是有一段核定位信号的依赖RNA 的多聚酶。EV713D蛋白是特异性依赖于Mn抖的聚合酶，而在Mg 存在条件下完全没有活性。体外转录活性研究结果表明，EV71 3D 蛋白以利用双核苷酸和十核苷酸RNA作为引物，以poly(c)和基因组RNA 为模板从头起始转录，DNA引物如寡聚dT可以增强其转录活性。3D蛋白第31l位氨基酸是其与VPg的结合位点，在VPg尿苷酰化过程中维持VPg分子结构的稳定。对第311位氨基酸位点进行突变后，VPg与3D蛋白的结合活性降低，尿苷酰化减少，病毒的复制受到抑制。这些结果显示3D蛋白对病毒复制起始促进和调节VPg尿苷酰化方面发挥重要作用，且第3ll位氨基酸位点有望成为新的抗病毒作用位点。

 

　　8 结语与展望综上所述，肠道病毒非结构蛋白的功能具有多样性，2A和3C蛋白加工病毒多聚蛋白，抑制宿主细胞蛋白表达及促进细胞凋亡，2B和2C蛋白诱导宿主细胞内膜及生化结构的改变，3A、3B及3D蛋白参与病毒复制。当前肠道病毒引起的疾病既没有合适的疫苗用于预防，也无有效的药物用于临床治疗，非结构蛋白详细的分子致病机制仍不完全清楚。

 

　　随着对肠道病毒非结构蛋白的深入研究，一些干扰病毒复制的宿主因子不断被发现，这对研究抗肠道病毒药物提供了新的思路，为今后预防及治疗肠道病毒引起的疾病奠定了坚实的基础。

 

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