继发性脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是原发性损伤后出现的一系列病理改变，严重影响了脊髓的功能恢复。研究发现，脑源性神经营养因子(Brain—derived neurotrophic factor，BDNF)在SCI后的表达明显增加，能改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化成熟、减少神经元凋亡等，在SCI后的功能修复中发挥重要作用。锌是调控BDNF及其受体表达的重要因子，能促进BDNF前体和成熟BDNF的表达。SCI后，锌的分布显著增加，而且与BDNF的表达呈正相关 。

 

　　本研究通过建立大鼠SCI模型，观察进食不同浓度锌对脊髓损伤大鼠BDNF表达的影响及神经功能的改善情况，为修复脊髓损伤提供新的思路。

 

　　1 材料和方法

 

　　1．1 主要试剂和仪器Cy3标记的山羊抗兔IgG(英国Abcam公司)，兔抗鼠BDNF多克隆抗体，共聚焦荧光显微镜，实时荧光定量PCR系统。

 

　　1．2 实验动物 60只3月龄健康雄性SD大鼠(275±25)g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物质量许可证号：SYXK (辽)2003—0011。

 

　　1．3 建立SCI模型和实验动物分组取健康雄性SD大鼠，清洁级，室温20～25 qC，应用水合氯醛(0．3 ms／kg)行腹腔注射麻醉。麻醉成功后，将大鼠固定于鼠台，消毒，铺巾，以胸10为中心，行纵行皮肤切口，暴露胸10节段脊髓，应用改良的Allen’S装置，用10 g金属锤从30 mm高自由落下，造成胸1O节段脊髓的冲击伤，依次逐层缝合。

 

　　造模成功的标准：脊髓冲击伤后，大鼠身体颤抖，双后肢收缩、搔弹，尾巴翘起后随即下垂，受损节段脊髓瘀血。

 

　　60只SD大鼠随机分成假手术组、模型组、低锌喂养组和高锌喂养组。假手术组暴露胸1O节段脊髓后逐层缝合，不行金属锤击打。低锌喂养组给予进食低锌饲料(锌：5 ms／kg)；高锌喂养组给予饮用硫酸锌水溶液(180 ms／kg)；其它动物给予适锌饲料(锌：30 mg／kg)。

 

　　1．4 BBB评分检测后肢运动功能采用BBB评分检测各组大鼠1、2、4 w后肢运动情况。为减少主观因素，评分采取双盲、双人评分。评分标准如下：0分：后肢无运动；1分：后肢一个或两个关节可见轻微活动；2分：后肢一个关节活动明显，或同时伴另一个关节轻微活动；3分：后肢两个关节活动明显；4分：后肢三个关节轻微活动；5分：

 

　　后肢两个关节轻微活动伴第三个关节明显活动；6分：后肢两个关节活动明显，第三个关节轻微活动；7分：后肢三个关节均明显活动；8分：关节节律性收缩与舒张，肢体侧卧位，脚掌不能负重；9分：可用足底负重片刻，或可见足背负重行走而非足底行走；10分：偶尔脚掌着地负重行走，前后肢步态不协调；11分：频繁或持续脚掌着地负重行走，前后肢步态不协调；12分：频繁或持续脚掌着地负重行走，偶有前后肢步态协调；13分：

 

　　频繁或持续脚掌着地负重行走，常见前后肢步态协调；14分：能一直负重行走且前后肢步态协调，脚掌着地或离地时后爪翻转；或前后肢步态协调，多用足底行走偶见足背行走；15分：能坚持负重行走，步态协调，脚趾无分开或前行时偶有分开；着地时后爪与身体平行；16分：能用后肢行走，步态协调，前行时脚趾多分开，着地时后爪平行而离地时翻转；17分：能用后肢行走，步态协调，前行时脚趾多分开，着地或离地时后爪相互平行；18分：能用后肢行走，步态协调，前行时保持脚趾分开，着地时后爪相互平行而离地时翻转；19分：能用后肢行走，步态协调，前行时保持脚趾分开；着地时后爪相互平行而离地时翻转，尾巴暂时或一直下垂；20分：能用后肢行走，步态协调，前行时保持脚趾分开：着地或离地时后爪相互平行，但肢体不稳，尾巴保持向上；21分：能用后肢行走，步态协调，前行时保持脚趾分开，后爪一直平行，肢体平稳；尾巴向上。

 

　　1．5 各组大鼠术后1 W脊髓HE染色各组动物术后1 W，进行后肢运动评分，随后麻醉， 自原造模切口逐层切开，迅速取出T10节段脊髓，4％ 中性多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋。连续切片，常规HE染色，中性树胶封片，光镜下观察切片。

 

　　1．6 实时定量PCR检测各组BDNF表达的实时定量PCR检测于动物模型建立后的1、2、4 W，将每组大鼠随机选择5只，麻醉后处死。取损伤脊髓组织，应用Trizol试剂提取出总RNA，随后反转录为cDNA，应用实时荧光定量PCR系统检测各组大鼠脊髓中BDNF表达的情况。反应体系置于95℃ 环境10 min后，按下面顺序连续循环40次：95℃ 30 S，5℃=1 min，72℃ 1min。设定无模板对照以除外假阳性，上述步骤重复3次。以GAPDH为内参，BDNF和GAPDH 的引物序列同以前研究 ，采用AACt方法行相对定量分析。

 

　　1．7 统计学分析采用SPSS17．0软件对实验数据进行统计学处理，结果均用 ±s表示，多组均数比较采用单因素方差分析及两两比较的方法。P<0．05则认为差异有统计学意义。

 

　　2 结 果

 

　　2．1 后肢运动功能评估60只大鼠术前BBB评分均为21分，精神状态良好，活动正常。模型组、低锌喂养组和高锌喂养组大鼠经Allen’S法击打后，双后肢不完全瘫痪，BBB评分为1～3分，提示造模成功。伤后1 W，4组大鼠瘫痪程度均有所改善，组间无明显差异；伤后2 W，高锌喂养组大鼠BBB评分明显高于模型组和低锌喂养组，差异有显著性意义(P<0．01)；伤后4 W，高锌喂养组大鼠BBB评分显著增高，低锌喂养组评分低于模型组，组间差异有显著性意义(P<0．01)，见表1。

 

　　2．2 脊髓病理改变术后1 W对各组大鼠脊髓石蜡切片行HE染色，假手术组大鼠脊髓HE染色未见明显损伤，核仁及尼氏体清晰可见，见图1(A)；模型组大鼠可见较多空泡形成，神经元变性坏死，细胞核显示不清，核仁与尼氏体消失，脊髓损伤严重，见图1(B)；低锌喂养组大鼠脊髓HE染色与模型组相似，见图1(C)；高锌喂养组大鼠脊髓HE染色无空泡形成，可见核仁及尼氏体，与模型组及低锌喂养组比较脊髓损伤减轻。

 

　　2．3 实时定量PCR检测BDNF表达脊髓损伤术后第1、2周和第4周，实时定量PCR检测各组大鼠脊髓的BDNF表达：假手术组BDNF的表达随时间的延长无变化；模型组BDNF表达逐渐增多，到第4周又下降；低锌喂养组BDNF表达趋势与模型组相似，绝对值小于模型组，两组问比较无统计学意义；高锌喂养组BDNF表达量在每个时间点均明显高于其他3组，组间差异有显著性意义(P<0．O1)。

 

　　3 讨 论中国SCI患者现有约100万，而且以每年1万人的速度在递增。由于SCI治疗困难，患者伤后障碍多、并发症多，是残疾人中最为困难的人群，给社会和家庭带来沉重的经济负担。

 

　　脑源性神经营养因子(Brain—derived neuro—trophic factor，BDNF)可促进神经元的存活和突起生长，参与调节神经元的分化和增殖存活。采用外源性BDNF修复SCI可取得一定效果 ，但外源性BDNF有宿主排斥反应、不易通过血脑屏障、安全性难以保证等问题。如果能寻找出调控内源性BDNF及其受体表达的有效途径，促进内源性BD—NF的合成、释放及与受体结合，将在体内建立有效的保护机制，从而减轻脊髓继发性损伤。

 

　　锌是机体必需的微量元素，广泛存在于神经系统中，参与许多生物学活动的调节。虽然锌超载能导致神经元死亡，但锌离子还是调控BDNF及其受体表达的重要因子。本研究通过实时定量PCR检测各组大鼠脊髓的BDNF表达：模型组BD—NF表达逐渐增多，到第4周又下降；高锌喂养组BDNF表达量在每个时间点均明显高于其他3组，组间差异有显著性意义(P<0．O1)。首先，锌缺可下调生长期鼠海马和皮层的BDNF mRNA的表达水平；而高锌处理可上调成年鼠大脑皮质BDNF基因表达，从而促进BDNF 的合成与释放；其次，锌离子从含锌神经元轴突终末释放能激活金属蛋白酶，促进BDNF前体和成熟BDNF的表达。

 

　　BBB评分适用于全脊髓损伤模型及挫伤模型，本研究选择BBB评分简单、易行，由于采用双盲、双人评估，将主观因素降到最低。自术后2 W起，高锌喂养组大鼠BBB评分明显高于模型组和低锌喂养组，差异有显著性意义(P<0．01)。伤后4W，低锌喂养组BBB评分低于模型组，组间差异有显著性意义(P<0．01)。术后1 w对各组大鼠脊髓HE染色结果表明：高锌喂养组大鼠脊髓HE染色无空泡形成，可见核仁及尼氏体，与模型组及低锌喂养组比较脊髓损伤减轻。以上实验结果提示：

 

　　脊髓损伤后，饮食中锌元素缺乏可导致脊髓损伤加重，而进食足量锌则可减轻脊髓损伤，促进大鼠运动功能的恢复。

 

　　本实验成功建立大鼠Allen’S脊髓损伤模型，观察到进食较高浓度锌可促进脊髓损伤大鼠BDNF的高表达并能改善大鼠后肢神经功能。但本研究分组较少，锌浓度过高可能造成毒性损伤，今后将增加不同实验亚组，检测出最适给锌浓度，其内在的作用机制也有待于进一步研究。

 

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