失血性休克是临床常见的危重症，经历休克和复苏存活的患者往往会发生难以控制的系统性炎症反应致终末器官损伤。肺是最易受累器官之一，研究表明多种因素导致失血性休克后急性肺损伤(acutelung injury，ALI)的发生，其中炎症介质在休克后ALI和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory dis—tress syndrome，ARDS)的发生中发挥关键作用，并成为该类患者死亡的主要原因 。本实验通过复制失血性休克大鼠模型，观察c肽对失血性休克大鼠血浆中促炎性细胞因子表达以及肺炎症反应程度的影响，探讨其发生机制，为探寻新的治疗策略提供思路。

 

　　1 材料与方法

 

　　1．1 动物来源与分组 雄性Wistar大鼠(3～4月龄，体重300～350 g，浙江中医药大学实验动物中心提供)，随机分为3组，每组8只。假手术组(Sham组)：麻醉后实施手术但未失血和复苏；乳酸钠林格液复苏组(RL组)：麻醉后实施手术，失血致休克，予以乳酸林格液复苏；C肽复苏组(c肽组)：麻醉后实施手术，失血致休克，予以C肽复苏。

 

　　1．2 动物模型制作 2％戊巴比妥钠50 mg／kg腹腔注射麻醉，分离一侧股动、静脉并置人套管，股动脉套管监测平均动脉压及留作放血，股静脉套管注入复苏液体和放出的血液，放出的血液储存于无菌加肝素的容器中备用。所有实施手术后的大鼠观察10 min以达到稳态(大鼠血流动力学状态平稳并有自主呼吸)。以0．5 mL／min速度股动脉放血至平均动脉压(MAP)降为(40～50 mmHg，40±5 mmHg)，维持此血压，期间根据MAP的波动情况放出或回输血液使MAP维持于此范围内。1h后迅速复苏。

 

　　RL组：乳酸林格液于30 min内输入(总容量等于总失血量)；C肽组：1 mg／kg C肽溶于生理盐水于30 min内输入(总容量等于总失血量)；Sham组大鼠仅作动静脉置管并维持测压状态同样时程。各组分别于复苏2h后经股动脉采血2 mL，离心后取上清于一70℃ 冻存。放血处死大鼠。部分肺组织固定于福尔马林用于组织学分析。实验过程中应用Ma．clab生物信号采集系统监测心率和血压。

 

　　1．3 实验室检测 各组在麻醉、插管结束后稳定10 min，记录基础MAP，在休克模型建立及复苏期间每30 min重复记录一次；采用ONE TOUCH2 LIFES—CAN血糖自动分析仪测定血糖水平；采用ELISA法测定血浆白细胞介素一1(IL一1)、白细胞介素一6(IL一6)、肿瘤坏死因子一 (TNF—d)水平。所有试剂均购自武汉博士德公司。

 

　　Westing-blot检测肺组织核转录因子(NF—KB)蛋白表达水平：肺组织加入细胞裂解液于匀浆器中匀浆后提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。蛋白质按SDS．PAGE电泳分离，BioRad电转移装置电转移蛋白至硝基纤维素膜，丽春红可逆染色确定蛋白Mark位置，依次加一抗、二抗，TTBS洗膜，BCIP／NBT显色、拍照。各蛋白的相对含量以目的蛋白与内参照B一肌动蛋白(3-actin)蛋白表的灰度比值表示。

 

　　采分光光度计法测定肺组织髓过氧化物(MPO)活性。

 

　　1．4 肺组织学分析 取肺组织固定于4％ 中性福尔马林，脱水、石蜡包埋、切片，HE染色。高倍镜下观察肺组织的病理改变。

 

　　1．5 统计学分析 采用SPSS17．0统计软件包进行分析。计量资料以表示，两组间比较采用t检验，三组间比较采用方差分析；所有统计分析均采用双侧检验，P<0．05为有统计学意义。

 

　　2 结 果

 

　　2．1 各组MAP变化各组初始状态(0 min)MAP没有差异，平均值在130 mmHg左右。模型复制后RL组、c肽组(30～60 min)MAP稳定于45±5 mm—Hg，Sham组不变。复苏后2 h，C肽组MAP明显高于RL组(t= 一11．07，P<0．01)。

 

　　2．2 血糖水平、血浆IL一1、IL一6、TNF． 水平、肺组织MPO含量及NF—KB蛋白的表达结果显示，三组血糖水平无差异(P>0．05)；与Sham组相比较，c肽组与RL组肺组织MPO活性均升高(P<0．O1)，血浆IL一1、IL一6、TNF- 水平显著升高(P<0．01)，肺组织NF-KB蛋白表达增加(P<0．01)；C肽组与RL组相比，肺组织MPO活性、血浆IL一1、IL一6、TNF一0水平、肺组织NF-KB蛋白表达均明显降低(P<0．01)。

 

　　2．3 肺组织病理学变化 RL组肺组织肺泡壁增厚，肺间质水肿，肺泡腔内有大量的红细胞及中性粒细胞浸润；C肽组肺组织炎性细胞浸润明显减少，肺间质和肺泡病理改变明显减轻。

 

　　3 讨 论失血性休克复苏后发生严重的系统性炎症反应是导致ALI和ARDS的主要原因。近年研究发现，胰岛素原分子的裂解产物c肽与细胞膜G蛋白偶联受体特异性结合后可产生多种细胞内效应，改善器官和细胞的功能，发挥调节和保护作用。

 

　　MPO是反映呼吸系统炎症和损伤的一个良好指标，与中性粒细胞的聚集程度有关。本研究结果发现，c肽组与RL组相比，肺组织MPO活性明显降低，提示c肽可减轻失血性休克后中性粒细胞浸润和肺损伤。病理学检测也发现，RL组大鼠肺组织有典型病理学改变，表现为肺泡壁增厚、肺间质水肿、肺泡腔内有大量的红细胞及中性粒细胞浸润等，而C肽组上述病理改变则明显减轻。我们认为，在失血性休克再灌注阶段予以c肽可减轻肺组织损伤和炎症反应，而这种保护作用可能与C肽调控内皮细胞粘附分子如P．选择素、细胞间黏附分子1(ICAM一1)及血管细胞黏附分子一1(VCAM一1)的表达有关。Vish等 通过复制非DM啮齿动物脓毒血症模型，发现c肽可减轻肺间质、肺泡水肿，减轻肺泡损伤及炎性细胞浸润，认为c肽参与调控炎性反应。Scalia等 研究发现，在肠系膜损伤的大鼠，c肽可减少肠系膜血管内皮细胞表面粘附分子P一选择素及ICAM．1的表达，从而减轻白细胞滚动与粘附，减轻了血管损伤。而在非糖尿病(Diabetes mellitus，DM)动物如败血症和心肌缺血一再灌注损伤，c肽可介导白细胞与内皮胞间相互作用，调节一氧化氮(NO)生成及中性粒细胞浸润，从而发挥抗炎作用 。因此C肽作为一重要的调控因子在失血性休克时可能抑制肺组织炎症反应，减轻ALI。

 

　　由于ALI是肺组织失控性炎症反应的结果，NF—KB作为一重要促炎转录因子，参与组织损伤、炎症反应等。本研究发现c肽组NF．KB表达水平明显低于RL组，提示C肽可能通过抑制NF．KB核转位而弱化一些重要促炎介质如TNF—o、IL一1、IL一6等，减轻失血性休克后肺组织炎症反应，减轻肺损伤。同时本研究中c肽组与RL组血浆TNF．IL．1、IL．6水平明显高于Sham组，而与RL组相比，c肽组血浆TNF一0l、IL一1、IL一6水平明显下降，从而进一步证实了c肽对炎症的钝化效应 。

 

　　此外本研究显示c肽复苏可改善失血性休克大鼠的低血压状态，利于机体存活。因此，c肽作为一种经典的肽类激素，不仅仅是胰岛素分泌的标记之一，更在失血性休克时可能通过抑制促炎细胞因子的表达而减轻失血性休克诱发的急性肺损伤。

 

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