随着现代医学的不断发展，大量广谱抗菌素、各种激素、免疫抑制剂的广泛应用，血液系统恶性疾病、器官移植和艾滋病患者的增加，侵袭性真菌感染(invasive fungal infection)逐年增多，严重威胁患者的生命。据国外资料报道，艾滋病患者在其病程中患真菌感染的可能性为90％，真菌感染是艾滋患者的主要死亡原因，而我国HIV阳性人群特别是西南地区正以每年30％的速度增加。在发达国家，器官移植受者和恶性肿瘤患者中真菌感染的发病率高达20％～40％，而且往往是致命的感染。虽然感染的主要病原真菌仍然是念珠菌，但曲霉菌、接合菌及新生隐球菌等也在不断增加。这些真菌导致的侵袭性感染相对一般细菌、病毒感染具有更高的病死率，严重危害人类的健康。

 

　　绝大多数IFI患者无特异的临床表现，很难与其他侵袭性疾病区分，很大程度上依靠实验室的检查。传统的真菌感染的诊断依靠常规真菌分离、培养和组织病理鉴定等，培养需时长且难成功，病理不易鉴定，难以满足临床快速诊治的需要。国内外学者近年来已经开始逐步认识到深部真菌感染早期诊断的重要性 ，且取得了一些突破性的研究进展 ，为指导临床工作提供了较好的依据。本文就近年来IFI实验室在真菌感染诊断方而的研究进展综述如下。

 

　　1 组织病理学方法组织病理学是深部真菌感染重要的诊断方法之一，多年来人们一直致力于探讨组织病理学新方法鉴定组织中真菌的种属，以提高病原学诊断水平，并指导治疗。除常用的真菌病原体染色方法外，免疫组化方法通过检测真菌抗原特异地诊断组织中真菌病原体，如新生隐球菌、马尔尼菲青霉菌、曲霉菌和念珠菌等等。免疫染色除其诊断的特异性外，还可使组织中稀少存在的孢子更易发现，而免疫组化技术比组织化学方法更加敏感。免疫组化是继培养法这一金标准之后最特异的诊断真菌感染的手段之一。但免疫组化法并未完全解决种特异性问题，特别是对于曲霉菌。而原位杂交技术利用核酸分子碱基配对互补的原理检测目的基因，特异性强，近十几年来，已有数位研究者以此方法用于真菌感染的组织病理学研究，目前已有用于念珠菌感染、曲霉感染和卡氏肺孢子虫感染的报道 ，但该探针仍未能彻底解决与黄曲霉的交叉问题。随着真菌rDNA基因信息的完善和各种软件包的应用，探针的设计变得更准确和容易，费用明显降低，非放射性探针的标记使原位杂交更安全，越来越多的实验室有能力开展此项技术。

 

　　2 快速培养鉴定方法直接显微镜检查和病原体培养特别是血培养方法仍然是临床检测真菌血症的金标准。但由于很多病原体直接镜检检出率不高，病原体培养需要时间长，使危重患者的诊断治疗存在一定的延时性，而且这些常规技术常常受到检验人员的技术熟练程度和标本的采集方法、部位和采集时机等诸多主观因素的影响，有时不能够得到客观的阳性结果，常常延误了患者的最佳治疗时机。但培养法对于一些真菌可以进行药物的敏感性实验，为临床的用药提供支持，且不同的菌株毒力和药物敏感性各不相同，所以将分离菌鉴定到种的水平对临床非常重要。因此很多学者致力于传统方法的改进以求更加准确、快速地鉴定侵袭性真菌 。为了提高培养的阳性率进行 很多改进，如解离离心培养管和自动监测的血培养瓶的应用等等，在一定程度上缩短了结果报告的时限。

 

　　系统性真菌感染目前仍然以酵母样真菌为主，临床上已有各种商品化的鉴定培养基和试剂盒供应。其中最简便的方法是科玛嘉显色培养基，利用酵母样真菌在生长过程中产生的酶作用于培养基中的色原底物，使菌落在生长过程中呈现不同的颜色来鉴定酵母菌，可准确鉴定白色念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌等。另外酵母鉴定板和自动生化鉴定系统的应用为非白念珠菌的鉴定提供了方便，目前常用的鉴定板有API20C AUX、ID32、RAPID Yeast plus，自动生化鉴定系统包括Vitek鉴定系统、Quantum II、Biolog系统等等，尽管在敏感性和特异性方面也存在一定的问题，尤其足对毛孢子菌、都柏林念珠菌和隐球菌的鉴定。因此临床迫切需要发展新技术，建立完善的非培养的快速诊断深部真菌病，且能够对客观评价疗效和预后皆有指导意义的方法。

 

　　3 血清学检测方法抗体检测用于常见条件性侵袭性真菌感染，早期诊断价值不大，难以达到较高的敏感性和特异性，原因主要是占深部真菌感染90％以上的念珠菌是正常菌丛之一，正常人血中也有高效  价的抗体；另外系统性真菌感染多发生于免疫机能不正常的患者，难于产生抗体，常会出现假阴性结果。但真菌抗体检测对某些地方性条件性真菌感染显示出一定的应用价值。AlexanderBD等 利用从真菌提取的天然抗原，成功建立了多种地方性真菌病血清学检测方法，用于包括芽生菌病、球孢子菌病，组织胞浆菌病、副球胞子菌病和毒霉病的早期诊断及流行病学调查，并显示出较高的敏感性和特异性。

 

　　念珠菌抗原由于在血循环中很快被清除，因此抗原检测也难以达到预想的敏感度，但相比之下抗原检测比抗体检测具有更高的诊断价值，因此近年来一些针对真菌细胞壁抗原、代谢产物等检测的新方法成为研究热点，其中一些试剂已有商品化试剂盒，也在临床逐步应用。如半乳甘露聚糖(GM)是第一个用于侵袭性曲霉菌病的抗原检测。Mart KA等用曲霉菌的半乳甘露聚糖酶免疫分析法检测患者的血清结果表明，以0．5为阳性临界值可提高检测的敏感性和特异性。但GM血症常为一过性，故应对高危人群进行动态监测。除GM检测曲霉的半乳甘露糖抗原外，目前检测的真菌抗原还有如检测血清中抗烯醇化酶抗体、分泌型门冬酰胺蛋白酶(secreted aspartyl proteinase，Sap)和甘露聚糖抗体等来诊断深部念珠菌感染。但依靠这些检测手段的单一方法敏感度和特异度都不够稳定，可采用联合抗原检测的方法。甘露聚糖为念珠菌细胞壁成分，Bio—Rad公司已有试剂盒(Platelia Candida antigen test)应用于临床，一般将甘露聚糖抗原检测与抗体检测相结合，有助于念珠菌感染的早期诊断及提高诊断的灵敏度。李若瑜等。采用酶联免疫吸附试验检测念珠菌甘露聚糖敏感度为64．3％，特异度为97．2％；曲霉菌半乳甘糖抗原的酶联免疫吸附试验的敏感度在50％ 一90％之间。烯醇化酶为白念珠菌胞浆蛋白，研究显示只有在深部白念珠菌感染时才大量释放烯醇化酶，而寄生在体表部位的白念珠菌一般不会释放此酶。(1—3)一B—D一葡聚糖(BG)是许多真菌细胞壁的结构成分，是一种真菌广谱循环标志物，细菌、病毒和哺乳动物体内不含该成分，因此可作为深部真菌感染的指标。目前已有多种商业化方法检测BG，在世界范围应用广泛，检测敏感度为78％ ～100％，特异度为88％～100％。

 

　　BG可用于早期发现深部真菌感染，但不能区分是何种真菌感染，另外新生隐球菌感染并不能在血及脑脊液中测到BG，接合菌属如毛霉菌和根霉菌由于细胞壁缺乏(1—3)一B—D一葡聚糖，所引起的感染也无法检测。所以提倡将BG检测和GM检测联合起来，可以增加诊断的敏感性。

 

　　随着质谱分析技术的不断进展，血清真菌代谢产物检测也得到迅速发展。真菌代谢产物主要包括D一阿拉伯醇、L一阿拉伯醇和甘露聚醇。采用酶荧光法检测血、尿标本D一阿拉伯糖醇／肌酐比值或GC—MS法检测血、尿标本D一阿拉伯糖醇／L一阿拉伯糖醇比值，可快速预测系统性念珠菌感染，但由于不能发现不产生D一阿拉伯糖醇的克柔念珠菌、光滑念珠菌和新生隐球菌等三种真菌，目前很难在临床实验室应用。快速发展起来的质谱分析技术不仅用于真菌感染的诊断检测，也广泛应用于真菌毒素的检测。Jegorov A等 使用质谱分析，根据特异真菌代谢产物快速地鉴定4O多个不同真菌菌株。但由于检测费用的原因，质谱分析目前并不能在临床实验室广泛应用。

 

　　4 分子生物学方法近年来，分子生物学技术已成功地应用于某些深部真菌感染的诊断以及耐药基因的检测。分子生物学主要以聚合酶链反应(plymerase chain reaction，PCR)技术为基础的一系列分子诊  断方法，通常先采用真菌通用引物对待检标本进行扩增，然后再采用属或种特异性引物对扩增产物进行二次扩增，即将DNA放大数百万倍后再进行测定，所以远比培养法敏感，可以简便、快速地鉴定多种医学重要真菌，广泛应用于病原真菌的分型、鉴定和亲缘关系的研究。PCR技术的应用是目前真菌感染诊断中最活跃的领域。

 

　　由于白念珠菌和曲霉菌是临床常见感染真菌，其分子生物学诊断研究进展也比较快，目前主要有基于白念珠菌ITS、rD—NA、IGS基因保守区的普通PCR、PCR—RFLP、RAPD、Real—time—PCR及针对胞外抗原基因的EIA、PCR—EIA等。其中聚合酶链反应单链构象多肽性分析(PCR—SSCP)可将曲霉鉴定到属的水平，并可一次性对烟曲霉和黄曲霉进行鉴别。随机扩增多肽性DNA(RAPD)分析通过扩增靶核苷酸细胞DNA，经凝胶电泳进行DNA片断大小及数量的多肽性分析，已应用于酵母菌及曲霉菌的鉴定、分类和流行病学研究，方法简便可以大规模使用，但重复性相对较差，常采用多种随机引物进行PCR扩增和与其他方法联合应用，提高稳定性 。限制性片段长度多态性分析(PCR—RFLP)利用不同种属的真菌基因组DNA顺序存在差异，使用核酸限制性内切酶识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，酶切后产生的特异DNA片段经琼脂糖凝胶电泳形成酶切图谱，借此可对相近菌种或同种内变种进行分析。实时荧光定量PCR(real—time—PCR)技术即在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析，可对临床重要曲霉菌和念珠菌进行区分 。巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段，其敏感性比普通PCR要高1000倍。Pongpom等 应用巢式PCR检测血清中的马尔尼菲青霉菌DNA，检测敏感度100％，特异性达到68．6％。赵军等采用自行设计的烟曲霉特异性引物用巢氏PCR技术快速诊断侵袭性烟曲霉感染，在临床确诊或拟诊的侵袭性曲霉感染患者中，检测灵敏度和特异性分别达到100％和83．3％。而在曲霉菌感染的分子生物学诊断方面，基于核酸水平的普通PCR、两步PCR、实时PCR和基于表面抗原的ELISA免疫印迹等技术，以其特异性强、灵敏度高等特点在曲霉病的诊断及分型中发挥着日趋重要的作用。

 

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