研究表明，血管紧张素受体Ⅱ拮抗剂(angiotensin recep—tor blocker，ARB)对代谢综合征(metabolic syndrome，MS)患者除降压作用外，尚有降糖、调脂、改善胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)作用。ARB选择性抑制AT1受体，通过阻断AnglI介导的氧化应激(oxidative stress，OS)，从而改善IR，保护8细胞功能，但机制尚未完全明确。本研究利用高糖高脂饲料饲养SD大鼠，诱导大鼠发生IR后，一次性腹腔注射小剂量(20 mg／kg)链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，成功制作出类似人类2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠模型，并利用此模型观察ARB厄贝沙坦干预对T2DM 大鼠胰岛结构和功能的影响，以探讨厄贝沙坦保护胰岛结构和功能的可能机制。

 

　　1 材料和方法

 

　　1．1 实验动物和试剂雄性健康SD大鼠4O只，6-8周龄，体重200-260g，合格证号：SCXK桂2009—0002，由广西医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后，采用抽签式随机分为4组，每组1O只，即A组(普通饲料组)一直予普通饲料饲养，B组(高糖高脂饲料组)一直予高糖高脂饲料饲养；C组(T2DM 对照组)、D组(厄贝沙坦干预组)予高糖高脂饲料饲养8周后造模。普通饲料和高糖高脂饲料均由北京科澳协力饲料有限公司提供。STZ(Sigma公司，批号：Sigma—S0130)；优越血糖仪(AccU CHEK Advantage，罗氏诊断公司)；厄贝沙坦(杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司，国药准字J20030113)；胰岛素放射免疫分析药盒由中国原子能科学研究院，北京北方生物技术研究所提供，批准文号：国药准字S10930046；胰岛素抗体(美国santa cruz biotechnology，inc。

 

　　批准文号：SC 9168)，二抗Supervision Anti—Rabbit DetectionReagent(HRP)货号：Cat．NO．D-3002、DAB显色液由上海长岛生物有限公司提供。

 

　　1．2 DM 动物模型的建立参照文献造模：禁食12h以上，称重，一次性腹腔注射小剂量(20 mg／kg)现配的2Vo STZ溶液，A、B组一次性腹腔注射等量的0．1 mol／L柠檬酸缓冲液，72 h后采尾部末梢血，用血糖仪测随机血糖(random blood glucose，RBG)，以RBG≥ 16．7 mmol／l 为造模成功。造模成功后继续高糖高脂饲料饲养，此后每72 h测定1次RBG，1周后血糖稳定，RBG≥16．7 mmol／L者进入C组、D组。造模成功后，D组予厄贝沙坦50 mg／kg灌胃干预12周，同时其余3组予等量生理盐水灌胃12周。

 

　　1．3 腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerancetest，IPGTT)厄贝沙坦干预12周后，各组大鼠进行IPGTT_4]。采用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)及注射葡萄糖后3O，60，120 rain血糖；采用放射免疫法检测空腹血胰岛素(fasting serum insulin，FSI)及注射葡萄糖后3O，60，120 min血胰岛素，用大鼠标准品绘制标准曲线，并计算如下指数：(1)稳态模型评价胰岛素抵抗指数(homeostasismodel assessment of insulin resistance，HOMA—IR)，其计算公式：H0MA—IR-二FBG(mmol／L)×FSI(mU／L)／22．5。

 

　　(2)胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index，ISI)，其计算公式：ISI一(1／FBG×FSI)的自然对数。

 

　　1．4 胰腺标本的采集大鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉，打开腹腔，充分暴露手术视野。小心分离出胰腺，置于冰冷生理盐水清洗血污，剔除脂肪及结缔组织等杂质，滤纸吸干，切取适量胰腺组织，部分置于4多聚甲醛中固定，以进行HE染色、免疫组化染色等检测；部分标本迅速放人液氮中冻存，留待进行逆转录聚合酶连反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT—PCR)检测胰岛素基因表达情况。

 

　　1．5 胰腺组织HE染色胰腺组织经固定、梯度酒精脱水、二甲苯脱水、浸蜡、包埋后切片，厚度4mm，再进行HE染色。

 

　　1．6 胰腺胰岛G细胞免疫组化染色及分析采用两步法进行，参照文献[5]对胰腺胰岛17细胞免疫组化染色结果进行分析。棕黄色颗粒为免疫组化阳性信号，并采用彩色图像分析系统对胰岛内13细胞相对量(面积比)，以及13细胞胞质内的胰岛素水平进行量化测定(光密度值)。

 

　　1.7 RT—PcR测定胰腺内胰岛素mRNA表达水平严格按照试剂盒所提供的说明书制作胰腺组织匀浆，采用Trizol Reagent试剂提取总RNA；进行逆转录合成cDNA；配制PCR反应体系进行PCR扩增；琼脂糖电泳；使用胶回收的方法纯化DNA片段作为标准品；在Bio Rad公司iCycleriQ荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR；标准曲线的制作：

 

　　以纯化的内参基因3-Actin及胰岛素基因的DNA片段为标准品，按8个梯度1O倍稀释为1O 、1O 、1O 、1O 、1o。、1O。、1O 、10，将以上标准品和样本管同时进行荧光定量PCR 反应，自动读取相对表达量；结果分析：每个反应管均设3个复孔，采用标准曲线法计算两者mRNA的相对表达量。胰岛素mRNA 相对表达量／13-Actin—mRNA相对表达量为胰岛素一mRNA表达量校正值。

 

　　1．8 统计学分析采用SPSS13．0统计软件进行统计学处理。计量资料用均数±标准差( ± )表示，组间比较采用单因素方差分析q检验及重复测量设计的方差分析。以P< 0．05为差异有统计学意义。

 

　　2 结 果

 

　　2．1 4组大鼠体重变化比较实验前各组大鼠体重比较差异无统计学意义(P >

 

　　0．05)。第8周B、c、D组大鼠体重显著增加，与A组比较，差异有统计学意义(P<0．O1)。厄贝沙坦干预12周后，C组体重下降最明显，与D组比较，差异有统计学意义(P<0．01)，下降幅度达53．28 ，而D 组体重下降幅度为21．52 ；A组、B组体重仍持续增加，各组体重与干预前体重比较，差异有统计学意义(P<0．O1)。

 

　　2．2 4组大鼠生化指标的变化(见表2)C组FBG显著增高，与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P<0．01)；D组FBG较C组下降25．O8 ，两组比较，差异有统计学意义(P<0．01)；D组FBG虽有所下降，仍高于A、B组，与该两组比较，差异有统计学意义(P<0．01)。

 

　　c组FSI水平显著增高，与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P G0．01)；D组FSI较C组下降7．99%，两组比较，差异有统计学意义(P<0．01)；D组FSI虽有所下降，仍高于A组，两组比较，差异有统计学意义(P<O．01)；D组与B组比较，差异无统计学意义(P>0．05)。

 

　　c组ISI水平最低，与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P<O．O1)；D组ISI较C组提高11．93%，两组比较，差异有统计学意义(P<O．01)；4组间两两比较，差异有统计学意义(P<0．05)。

 

　　c组HOMA IR最高，与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P<0．01)；D组H0MA—IR较C组下降3O．87 ，两组比较，差异有统计学意义(P<0．O1)；4组间两两比较，差异有统计学意义(P<0．01)。

 

　　2．3 4组大鼠IPGTT结果比较与A组比较，B、C、D组IPGTT结果提示C组胰岛素时相分泌受损，B、D组胰岛素早时相分泌存在。厄贝沙妒预12周后，D组IPGTT 出现明显改善。

 

　　2．4 胰腺HE染色胰腺HE染色结果显示：A组胰腺结构清晰，胰岛分布广，胰岛呈圆形、卵圆形大小不一的细胞团，界限清楚、无包膜，胰岛B细胞结构正常，数量较多，胞质丰富，胞浆均匀红染，核圆形，无炎症细胞浸润(见图1A)；B组胰腺结构尚清晰，胰岛内p细胞数目相对减少，部分p细胞变形，胞浆呈空泡样变性，可见核固缩，细胞外基质增多(见图1B)；C组胰岛体积变小，胰岛数量减少，胰岛分布稀疏，胰岛G细胞数量减少、肿胀，密度减低，胞质着色浅，细胞核固缩，局部有炎症细胞浸润(见图1C)；D组胰腺结构较C组清晰，胰岛内0细胞数目较c组显著增加，部分8细胞变形，胞浆呈空泡样变性，可见核固缩，细胞外基质增多，局部有少许炎症细胞浸润(见图1D)。

 

　　2．5 胰岛8细胞免疫组化分析胰岛内8细胞相对量(面积比)：C组与A、B、D组比较分别下降54．28%、71．92%及67．35% ，c组与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P < 0．01)；与c组比较，D 组增加67．35 ，差异有统计学意义(P<O．01)；D组胰岛内0细胞相对量仍低于B组，两组比较，差异有统计学意义(P <0．01)；B组较A组增加38．6O%，两组比较，差异有统计学意义(P<O．01)，见表4、图2。

 

　　胰岛G细胞内胰岛素水平(光密度)：C组与A、B、D组比较分别下降31．91%、45．76%及43．86%，C组与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P<O．01)；与C组比较，D组增加43．86%，差异有统计学意义(P<0．01)；B、D组较A组分别增加25．53%、21．28%，与该两组比较，差异有统计学意义(P< 0．01)；B组与D 组比较，差异无统计学意义(P >0．05)。

 

　　胰岛G细胞胰岛素mRNA表达水平：C组胰岛素mR—NA水平与A、B、D 组比较分别降低11．03%、18．87%及9．79%，C组与A、B、D组比较，差异有统计学意义(P<0．01)；与C 组比较，D 组胰岛素mRNA 表达水平增高9．79％，差异有统计学意义(P< 0．01)；B组分别与A组及D组比较，差异有统计学意义(P < 0．01)；A、D组胰岛素mRNA水平接近，两组比较，差异无统计学意义(P>0．O5)。

 

　　3 讨 论T2DM 及其并发症的病因、发病机制迄今尚未完全阐明，而通过临床实践对T2DM 患者进行研究存在诸多难于解决的实际问题，因此，建立较理想的T2DM 动物模型，是研究T2DM 及其并发症的病因、发病机制和治疗的关键。

 

　　目前认为，高糖、高脂、高热量饮食是诱发IR及T2DM的重要的环境因素之一。经高糖、高脂、高热量饲养大鼠，诱导其产生IR后，再腹腔或尾静脉注射小剂量STZ来损伤胰岛0细胞功能，可模拟T2DM 的发生过程，是目前IR及T2DM 等研究的重要内容。影响T2DM 动物模型成模率及稳定性的主要因素包括高糖、高脂、高热量饲养时间、STz注射方法与剂量等，若高脂饲料饲养诱导时间太短或STZ剂量太小，则大鼠T2DM 造模成功率不高。本研究通过高糖、高脂、高热量饮食饲养SD大鼠8周，明显加重大鼠肥胖和IR后，再腹腔注射小剂量STZ(20 mg／kg)，成功建立大鼠T2DM 模型，造模成功率达100%。该模型的主要特点包括：

 

　　① 高糖、高脂、高热量饲料饲养8周后，大鼠ISI明显下降。

 

　　此时腹腔注射小剂量STZ，可破坏胰岛G细胞功能，导致血糖明显升高，达到T2DM 诊断标准。②有高血糖、高胰岛素血症、IR及胰岛素敏感性下降等人类T2DM 的主要特点。

 

　　胰腺胰岛病理学检查发现，胰岛8细胞胞内胰岛素水平、胰岛内G细胞相对量以及胰岛素mRNA 表达水平均显著降低，与普通饲料组相比，胰岛B细胞胞内胰岛素水平下降31．91%，胰岛内8细胞相对量减少了54．28%，胰腺内胰岛素mRNA水平下降l1．O3%，胰岛数量减少、体积变小，但仍保持一定的胰岛素分泌水平，与初发人类T2DM 时胰岛B细胞数量减少5O 相吻合。④ 胰腺病理表现为胰岛体积变小，胰岛数量减少，胰岛分布稀疏，胰岛B细胞数量减少、肿胀，密度减低，胞质着色浅，玻璃样变，细胞核固缩，局部有炎症细胞浸润等。

 

　　ARB可减少T2DM 及心衰的发生率，可降低高血压患者T2DM 的发生率。厄贝沙坦是否通过影响胰腺p细胞的结构和功能，从而影响T2DM 的病理生理过程迄今尚未明了。本研究结果发现，厄贝沙坦干预12周后，与c组大鼠比较，FBG 下降25．O8%，H0MA—IR 下降3O．87%，ISI提高11．93%，明显改善IPGTT，提示厄贝沙坦干预可明显改善T2DM 大鼠的胰岛素早时相分泌，改善IR状态，并明显改善T2DM 大鼠的IPGTT。近年来，有学者研究证实，替米沙坦、厄贝沙坦等除降压作用外，尚具有独特的部分性的过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferators activatedreceptor-gamma，PPAR一7)激动剂作用，能改善IR及糖耐量，起到降糖的作用。Sloniger等l9 学者发现，厄贝沙坦干预能显著提高大鼠骨骼肌胰岛素介导的葡萄糖转运，明显改善大鼠胰岛素敏感性。Munoz等研究发现，存在高胰岛素血症的Zucker大鼠中，其胰岛素通路信号传导功能减弱，而厄贝沙坦干预可显著改善高胰岛素血症，并提高胰岛素通路信号传导功能，改善Zucker大鼠IR状况。

 

　　同时本研究也观察到厄贝沙坦干预12周后，与C组大鼠比较，胰岛内B细胞相对量增加67．35%，胰岛p细胞内胰岛素水平增加43．86%，胰岛B细胞胰岛素mRNA表达水平增高9．79%；胰腺结构较C组清晰，胰岛内B细胞数目较c组显著增加，部分0细胞变形，胞浆呈空泡样变性，可见核固缩，细胞外基质增多，局部有少许炎症细胞浸润。结果提示厄贝沙坦干预可保护胰岛结构和功能。

 

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