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HPLC法测定人体血浆中异环磷酰胺及环磷酰胺的浓度

  异环磷酰胺和环磷酰胺为同分异构体,为常用的化疗药物,抗癌谱相似,广泛用于治疗常见恶性肿瘤。异环磷酰胺和环磷酰胺血药浓度的测定方法主要是高效液相色谱法,方法样品的预处理存在操作繁琐、不稳定、成本高等问题。本研究在氯仿萃取方法基础上进行改进,建立HPLC法测定异环磷酰胺和环磷酰胺血药浓度,以便更好地满足临床人体血药浓度检测及药代动力学研究的要求。
 
  1 材 料
 
  1.1 仪器:LC一10A高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括LC-10AT vP高压泵,SPD-10A VP紫外检测器,LC一10ATVP柱温箱,威玛通用色谱数据工作站。
 
  1.2 试药:环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司,含量>
 
  99.5%,批号20070602);异环磷酰胺(江苏恒瑞医药有限公司,含量>99.5%,批号20070801);乙晴为色谱纯;氯仿、无水硫酸钠均为分析纯,实验用水为双重蒸馏水。
 
  2 方法与结果
 
  2.1 对照品和内标溶液的配制:分别精密称取异环磷酰胺、环磷酰胺对照品5O.00mg,分别置于50 mL量瓶中,用流动相溶解并稀释至亥 度,得浓度均为1 000 mg·L 环磷酰胺和异环磷酰胺对照品储备液,于冰箱4℃ 保存。用流动相分别稀释异环磷酰胺和环磷酰胺储备液至250 mg·L 作内标工作液;用流动相分别稀释异环磷酰胺和环磷酰胺储备液至500.0,250.0,100.0,5O.0,25.0,10.0,5.0 mg·L 作异环磷酰胺和环磷酰胺工作液;另用流动相分别稀释异环磷酰胺和环磷酰胺储备液至250,125,12.5 mg·L 作质控溶液;于冰箱4℃ 保存。
 
  2.2 色谱条件:色谱柱:Zorbax-ODS Cl8(4.6 mm× 250mm,5m),柱温:室温。流动相:乙晴水(25:75),流速1.0 mL·min一,检测波长;200 nm,进样量为2O L。在此条件下异环磷酰胺、环磷酰胺的出峰时间约为11.16 min与12.31 min。
 
  2.3 样品预处理:取5 mL试管,加入1.5 g的无水硫酸钠,精确吸取250 L血浆样品于试管中,精确加入内标液(250 mg·L 环磷酰胺或250 mg·L 异环磷酰胺20 L),放置2 min,待无水硫酸钠将血浆吸附完全后,用2.0,1.0 mL氯仿提取,合并提取液,水浴5O ℃ 通氮吹干,用100 L流动相溶解,离心5 min(15 000 r·min ),取上清液2OL进样。
 
  2.4 方法专属性考察:取250 L空白血浆分别加入2O L浓度为250 mg·L 环磷酰胺和异环磷酰胺工作液,依2.3方法操作,取上清液2O L进样测定,异环磷酰胺的保留时间为11.16 min,环磷酰胺保留时间为12.31 min。结果表明,空白血浆中内源性物质不干扰目标物的测定,结果见图1。
 
  2.5 线性范围和检出限:取健康人空白血浆,加入异环磷酰胺或环磷酰胺工作液,配制异环磷酰胺、环磷酰胺浓度分别为1.0,5.0,10.0,25.0,50.0,100.0,200.0 mg·L 血浆样品,按2.3方法操作。以异环磷酰胺或环磷酰胺与内标的峰面积比(Y)对异环磷酰胺或环磷酰胺的浓度(X)进行线性回归。异环磷酰胺回归方程为y一0.018X+0.015(r一0.999 8,一7),血浆中异环磷酰胺浓度在1.0~200 mg·L。范围内呈良好的线性关系;环磷酰胺回归方程为Y-二0.020X+0.014(r一0.999 9, 一7),血浆中环磷酰胺浓度在1.0~200mg·L 范围内呈良好的线性关系。在此色谱条件下,以信噪比(S/N)为3,此方法血浆中异环磷酰胺、环磷酰胺的最低检出限分别为0.2o mg·L 和0.25 mg·L~。A:空白血浆;B:空白血浆+ 异环磷酰胺(20 mg·L )+环磷酰胺(20 mg·L );C:病人A环磷酰胺血药浓度;D:病人B异环磷酰胺血药浓度;1:异环磷酰胺;2:环磷酰胺
 
  2.6 提取回收率:取健康人空白血浆,分别加入异环磷酰胺、环磷酰胺工作液,配制异环磷酰胺、环磷酰胺浓度分别为5.0,50.0,100.0 mg·L。血浆样品,每个浓度5份,按2.3方法操作,记录峰面积;另取12.5,125.0,250.0 mg·L。低、中、高3个浓度异环磷酰胺、环磷酰胺质控溶液直接进样分析,记录峰面积,将血样中峰面积与相应质控溶液峰面积相比,计算提取回收率。
 
  2.7 精密度和相对回收率:取健康人空白血浆,分别加入异环磷酰胺、环磷酰胺工作液,配制异环磷酰胺、环磷酰胺浓度分别为5.0,50.0,100.0 mg·L 血浆样品,每个浓度5份,按2.3方法操作,用标准曲线计算血样中异环磷酰胺、环磷酰胺的浓度,计算相对回收率,同日内每种浓度的样品平行操作5次和每天1次连续考察5 d,分别计算方法的日内、日间精密度。
 
  2.8 稳定性考察
 
  2.8.1 储备液的稳定性考察:取异环磷酰胺及环磷酰胺质控溶液在1,7,1 5,30,45,60 d直接进样2OL,记录峰面积。
 
  结果:异环磷酰胺、环磷酰胺的峰面积的RSD分别为1.5%,1.3%,表明异环磷酰胺、环磷酰胺至少在60 d内稳定。
 
  2.8.2 血浆样品存放期间的稳定性考察:取健康人空白血浆数份,加入异环磷酰胺、环磷酰胺工作液,配成浓度为50.0mg·L 血浆样品,放置20℃冰箱中,反复冻融6次,处理后进样,考察其冻融稳定性,结果:异环磷酰胺、环磷酰胺峰面积RSD分别为3.0%、2.8%。另外在第0,5,10,20,30天时取样分析,考察存放期间的稳定性,结果,异环磷酰胺、环磷酰胺峰面积RSD分别为2.7%、2.5%。表明含异环磷酰胺、环磷酰胺血浆在一2O℃ 冰箱中30 d是稳定的。
 
  2.9 方法应用:病人A,女,4O岁。人院诊断为食道淋巴瘤,收住于本院化疗科,按医嘱于2008年8月10日静脉推注环磷酰胺1 g,用药6 h后,抽取病人前臂静脉血样,测定环磷酰胺血药浓度为8.01 mg·l。病人B,男,16岁。入院诊断为左胫骨上段骨肉瘤,收住于本院化疗科。按医嘱于2008年8月10日用异环磷酰胺5 g化疗,静脉滴注3 h,结束后6 h抽取病人前臂静脉血样,测定异环磷酰胺血药浓度为44.48 mg·L。提示建立的检测方法准确、快速,适用于异环磷酰胺、环磷酰胺血药浓度监测。
 
  3 讨 论文献报道测定异环磷酰胺、环磷酰胺血药浓度样品预处理方法有采用固相萃取小柱萃取、氯仿萃取以及有用甲醇沉淀等方法。固相萃取小柱成本高,不利于大样本量的使用;甲醇沉淀方法使样本体积增大,方法灵敏度降低,难以满足低血药浓度的检测要求,考察用氯仿提取方法,发现提取过程出现大量乳化现象,氯仿处于下层,吸取操作不方便,试验结果图谱杂质多,色谱峰分离不理想,回收率不稳定。我们采用无水硫酸钠将血浆样品中异环磷酰胺、环磷酰胺脱水吸附,再用氯仿将异环磷酰胺、环磷酰胺从硫酸钠中提取,该提取方法将液一液提取转化为液 固提取,由于氯仿位于上层,操作方法简单,快捷、避免乳化,试验结果回收率高且稳定,许多杂质吸附在硫酸钠中,因此,试验结果图谱杂质少、色谱峰分离理想。
 
  本试验建立的方法所需样本数少,样品处理简便、快速、灵敏度高,同时适用于异环磷酰胺、环磷酰胺血药浓度监测及药代动力学研究。
 
  本文是由学术期刊吧整理发布的医学论文,感谢你的阅读!
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