多肿瘤抑制基因p16与肿瘤发生发展的关系_护士进修杂志投稿须知
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1 p16(MTS1)基因的发现和基本结构
1992年美国Skolnick等在黑色素瘤患者中发现有与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)相结合的蛋白，但这种蛋白的基因未被克隆出，随后对100个黑色素瘤细胞系采用染色体步移法和序列标记位点图进行分析，发现1/2的肿瘤细胞在染色体9p21区发生频繁的基因突变，推测该区域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此后在许多人类肿瘤集及体外细胞系中均发现9p21区的缺失和突变。1993年，美国长岛冷泉实验室研究的细胞先驱Serano等利用酵母双杂和蛋白相关性筛选法(yeast two-hybrid protein interaction screen)发现并分离了特异性的细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16蛋白，证明p16与CDK4结合后cyclinD/CDK4复合物的催化作用明显降低，并克隆了p16的cDNA。1994年美国盐湖城Kamb等［3］和圣地亚哥的Nobori［4］分别报道发现一个新的抑癌基因：p16，两个研究小组发表了一项重要的研究成果发现一个新的抑癌基因：p16蛋白，证明p16与CDK4结合后cyclinD/CDK4复合物的催化作用明显降低，并克隆了P16的cDNA。Kamb［3］在对黑色素瘤染色体9p21易感区应用物理图(physical map)和序列标记位点图(sequence tagged stites,STSs)分析了100个黑色素瘤细胞系的纯合缺失，发现在两个区域与Serrano报道的p16序列相近，命名为多发性肿瘤抑制因子1(multiple tumor suppress 1,MTS1)和MTS2，其中MTS1和p16完全吻合，而MTS2与p16序列有93%相同，现命名为p15(kamb A.S
cience,94,264,436-440)。
2 作用机制
细胞增殖分裂是细胞最基本的生理活动，越来越多的研究证明，细胞分裂周期的精确性及定时性是正常细胞生长和分化所必需的，细胞作为机体的最小单位，其生长过程总是处于一种增殖的动态平衡之中，这才能保证机体正常的生长、发育。这就意味着细胞内必然存在着促进和抑制增殖两种体系［5］，包含于这一过程中的蛋白质及基因的改变与肿瘤发生及其恶性表形密切相关。典型的一个细胞周期包括有严格顺序的4个期即G1SG2M，它是由MPF(maturation promoting factor,MPF)所推动。并受到信号转导途径和反馈环路的精密调控。MPF含两种蛋白质组分，其一为cdc2蛋白(cell division cycle 2 protein)，另一为细胞周期蛋白(cyclin)，在整个细胞周期中cdc2蛋白的浓度是稳定的，它的活动受到细胞周期蛋白的调节，细胞是否进入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取决于其能否顺利通过若干关卡(check points)，其中最重要的是G1/S转换和G2/M转换。前者又称为“启动点(start)”或“限制点(restriction point)”，位于G1期末，DNA合成的起始，后者位于M期的初始。现已证明，激活的CDK在这两个转换过程中起关键作用［6］。在高等的真核细胞，细胞周期蛋白分为A、B、C、D、E五种，它们分别在细胞周期的不同时期积累，激活相关细胞周期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性。G1期细胞周期蛋白是指在G1或G1/S交界处发挥作用启动细胞周期并促进DNA合成的周期蛋白，有C、D、E等多种，其中cyclinD1能激活CDK4、6调节G1/S转换，促进细胞分裂周期由G1期进入到S期，进行DNA合成［7］，cyclinD实际上可以视为一种癌基因，其过度表达会导致细胞增殖失控。最重要的研究发现是CDK抑制因子与肿瘤生长密切相关，对于CDK抑制因子p21的研究首先证明了这一点，p21是作为含有PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在内的CyclinD-CDK四聚体复合物中的一员在正常人纤维母细胞中首先被发现的［7］。
3 p16基因及其产物在肿瘤中的失活机制
p16基因及其产物在人类许多原发性肿瘤和细胞株中发生改变，如脑肿瘤、头颈癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等［15］均发现较高的p16基因的失活，主要失活机制有：突变、纯合性缺失及5′CPG岛甲基化失活等。(1)p16基因的突变包括无义突变、错义突变和移码突变。其突变部位主要在外显子1和外显子2。虽然大部分肿瘤细胞系中检测到p16基因突变，但原发性肿瘤组织中除胰腺癌和食管癌及成胶质细胞瘤外，其他肿瘤p16基因突变率很低，SUN等［16］利用SSCP直接测序的方法在42例鼻咽癌和2个鼻咽癌细胞系均未发现p16基因的点突变，LO［17］等也发现在原发性鼻咽癌及鼻咽癌的异种移植物中均未发现p16基因突变。Zhang等只检测到4/68的原发性头颈鳞癌和1/9的头颈鳞癌细胞系中p16基因的点突变，所以点突变并不是p16基因失活的主要方式，且突变只有发生在编码p16蛋白4个钩状重复结构区域内的DNA序列，才导致p16蛋白失去对cyclinD/CDK的抑制作用，而蛋白羧基末端区对结合与抑制CDK活性并不重要。(2)Melo等［18］通过对一些细胞系和原发性肿瘤p16基因的研究发现p16基因的纯合性缺失是p16基因在肿瘤中失活的主要机制，85%的恶性间皮瘤、82%的星形细胞瘤、70%～90%的脑胶质瘤［13，16］、60%～70%的骨肉瘤、50%～60%的乳腺癌、胰腺癌和肾癌，25%～60%的恶性黑素瘤［19］、头颈部肿瘤［16］和白血病20%～50%的膀胱癌［17］、肺癌［12，16］、卵巢癌和淋巴瘤的细胞系中发生纯合性缺失。而在睾丸肿瘤、宫颈癌和结肠癌、神经母细胞癌［12］细胞系中未发现p16基因的纯合性缺失。且发现原发性肿瘤组织中p16基因的缺失率低于相应肿瘤细胞系［18］在乳腺癌［20］殖系肿瘤组织［21］未检测出p16基因的改变。(3)DNA甲基化对于正常胚胎的发育是必需的，但它的异常却能导致肿瘤的发生。近年来发现肿瘤细胞中出现染色体区域性高甲基化与抑癌基因功能的丢失有关，可能是肿瘤甲基化不平衡中的重要部分，基因启动子区域5′CPG岛甲基化常伴有基因的转录失活。CPG岛是基因组C、G富集区，细胞中约有40%的基因启动子区域具有CPG岛［22］。
正常情况下，除失活的X染色体［23］外，常染色体基因CPG岛均处于非甲基化状态，而在细胞癌变过程中(包括头颈部肿瘤)常染色体基因CPG岛存在广泛的甲基化p16基因的外显子1启动子区域存在一CPG岛，在被检测的正常组织中它处于非甲基状态。在一些p16等位基因较少发生点突变或纯合性缺失的人类肿瘤中，如小细胞肺癌株出现高比例(78%)的5′CPG岛甲基化而失去转录活性［24］；在乳腺癌(37%)、前列腺癌(60%)、肾癌(23%)细胞株中及原发性的乳腺癌(31%)和结肠癌(40%)也出现同样现象，特别是结肠癌细胞系中甲基化发生率高达97%，尤其是在一些未发生纯合性缺失的结肠癌细胞中，p16基因的两个等位基因都出现异常甲基化，并与其完全失活是相关的［25］。后来又发现在结肠癌病人的正常结肠黏膜也出现甲基化，这在正常细胞常染色体基因中是罕见的，一般岛都是非甲基化的。p16基因的甲基化失活也发生在其他原发性人类肿瘤：包括膀胱癌、肺癌、头颈部鳞癌［17，26］。
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1 p16(MTS1)基因的发现和基本结构
1992年美国Skolnick等在黑色素瘤患者中发现有与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)相结合的蛋白，但这种蛋白的基因未被克隆出，随后对100个黑色素瘤细胞系采用染色体步移法和序列标记位点图进行分析，发现1/2的肿瘤细胞在染色体9p21区发生频繁的基因突变，推测该区域含有黑色素瘤的易感基因［2］，此后在许多人类肿瘤集及体外细胞系中均发现9p21区的缺失和突变。1993年，美国长岛冷泉实验室研究的细胞先驱Serano等利用酵母双杂和蛋白相关性筛选法(yeast two-hybrid protein interaction screen)发现并分离了特异性的细胞周期素依赖性激酶4(CDK4)抑制蛋白(CDK4I)-p16蛋白，证明p16与CDK4结合后cyclinD/CDK4复合物的催化作用明显降低，并克隆了p16的cDNA。1994年美国盐湖城Kamb等［3］和圣地亚哥的Nobori［4］分别报道发现一个新的抑癌基因：p16，两个研究小组发表了一项重要的研究成果发现一个新的抑癌基因：p16蛋白，证明p16与CDK4结合后cyclinD/CDK4复合物的催化作用明显降低，并克隆了P16的cDNA。Kamb［3］在对黑色素瘤染色体9p21易感区应用物理图(physical map)和序列标记位点图(sequence tagged stites,STSs)分析了100个黑色素瘤细胞系的纯合缺失，发现在两个区域与Serrano报道的p16序列相近，命名为多发性肿瘤抑制因子1(multiple tumor suppress 1,MTS1)和MTS2，其中MTS1和p16完全吻合，而MTS2与p16序列有93%相同，现命名为p15(kamb A.S
cience,94,264,436-440)。
2 作用机制
细胞增殖分裂是细胞最基本的生理活动，越来越多的研究证明，细胞分裂周期的精确性及定时性是正常细胞生长和分化所必需的，细胞作为机体的最小单位，其生长过程总是处于一种增殖的动态平衡之中，这才能保证机体正常的生长、发育。这就意味着细胞内必然存在着促进和抑制增殖两种体系［5］，包含于这一过程中的蛋白质及基因的改变与肿瘤发生及其恶性表形密切相关。典型的一个细胞周期包括有严格顺序的4个期即G1SG2M，它是由MPF(maturation promoting factor,MPF)所推动。并受到信号转导途径和反馈环路的精密调控。MPF含两种蛋白质组分，其一为cdc2蛋白(cell division cycle 2 protein)，另一为细胞周期蛋白(cyclin)，在整个细胞周期中cdc2蛋白的浓度是稳定的，它的活动受到细胞周期蛋白的调节，细胞是否进入分裂周期以及分裂周期是否成功完成取决于其能否顺利通过若干关卡(check points)，其中最重要的是G1/S转换和G2/M转换。前者又称为“启动点(start)”或“限制点(restriction point)”，位于G1期末，DNA合成的起始，后者位于M期的初始。现已证明，激活的CDK在这两个转换过程中起关键作用［6］。在高等的真核细胞，细胞周期蛋白分为A、B、C、D、E五种，它们分别在细胞周期的不同时期积累，激活相关细胞周期蛋白激酶(CDK)，使之具有蛋白激酶活性。G1期细胞周期蛋白是指在G1或G1/S交界处发挥作用启动细胞周期并促进DNA合成的周期蛋白，有C、D、E等多种，其中cyclinD1能激活CDK4、6调节G1/S转换，促进细胞分裂周期由G1期进入到S期，进行DNA合成［7］，cyclinD实际上可以视为一种癌基因，其过度表达会导致细胞增殖失控。最重要的研究发现是CDK抑制因子与肿瘤生长密切相关，对于CDK抑制因子p21的研究首先证明了这一点，p21是作为含有PCNA(proliferating cell nuclear antigen)在内的CyclinD-CDK四聚体复合物中的一员在正常人纤维母细胞中首先被发现的［7］。
3 p16基因及其产物在肿瘤中的失活机制
p16基因及其产物在人类许多原发性肿瘤和细胞株中发生改变，如脑肿瘤、头颈癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等［15］均发现较高的p16基因的失活，主要失活机制有：突变、纯合性缺失及5′CPG岛甲基化失活等。(1)p16基因的突变包括无义突变、错义突变和移码突变。其突变部位主要在外显子1和外显子2。虽然大部分肿瘤细胞系中检测到p16基因突变，但原发性肿瘤组织中除胰腺癌和食管癌及成胶质细胞瘤外，其他肿瘤p16基因突变率很低，SUN等［16］利用SSCP直接测序的方法在42例鼻咽癌和2个鼻咽癌细胞系均未发现p16基因的点突变，LO［17］等也发现在原发性鼻咽癌及鼻咽癌的异种移植物中均未发现p16基因突变。Zhang等只检测到4/68的原发性头颈鳞癌和1/9的头颈鳞癌细胞系中p16基因的点突变，所以点突变并不是p16基因失活的主要方式，且突变只有发生在编码p16蛋白4个钩状重复结构区域内的DNA序列，才导致p16蛋白失去对cyclinD/CDK的抑制作用，而蛋白羧基末端区对结合与抑制CDK活性并不重要。(2)Melo等［18］通过对一些细胞系和原发性肿瘤p16基因的研究发现p16基因的纯合性缺失是p16基因在肿瘤中失活的主要机制，85%的恶性间皮瘤、82%的星形细胞瘤、70%～90%的脑胶质瘤［13，16］、60%～70%的骨肉瘤、50%～60%的乳腺癌、胰腺癌和肾癌，25%～60%的恶性黑素瘤［19］、头颈部肿瘤［16］和白血病20%～50%的膀胱癌［17］、肺癌［12，16］、卵巢癌和淋巴瘤的细胞系中发生纯合性缺失。而在睾丸肿瘤、宫颈癌和结肠癌、神经母细胞癌［12］细胞系中未发现p16基因的纯合性缺失。且发现原发性肿瘤组织中p16基因的缺失率低于相应肿瘤细胞系［18］在乳腺癌［20］殖系肿瘤组织［21］未检测出p16基因的改变。(3)DNA甲基化对于正常胚胎的发育是必需的，但它的异常却能导致肿瘤的发生。近年来发现肿瘤细胞中出现染色体区域性高甲基化与抑癌基因功能的丢失有关，可能是肿瘤甲基化不平衡中的重要部分，基因启动子区域5′CPG岛甲基化常伴有基因的转录失活。CPG岛是基因组C、G富集区，细胞中约有40%的基因启动子区域具有CPG岛［22］。
正常情况下，除失活的X染色体［23］外，常染色体基因CPG岛均处于非甲基化状态，而在细胞癌变过程中(包括头颈部肿瘤)常染色体基因CPG岛存在广泛的甲基化p16基因的外显子1启动子区域存在一CPG岛，在被检测的正常组织中它处于非甲基状态。在一些p16等位基因较少发生点突变或纯合性缺失的人类肿瘤中，如小细胞肺癌株出现高比例(78%)的5′CPG岛甲基化而失去转录活性［24］；在乳腺癌(37%)、前列腺癌(60%)、肾癌(23%)细胞株中及原发性的乳腺癌(31%)和结肠癌(40%)也出现同样现象，特别是结肠癌细胞系中甲基化发生率高达97%，尤其是在一些未发生纯合性缺失的结肠癌细胞中，p16基因的两个等位基因都出现异常甲基化，并与其完全失活是相关的［25］。后来又发现在结肠癌病人的正常结肠黏膜也出现甲基化，这在正常细胞常染色体基因中是罕见的，一般岛都是非甲基化的。p16基因的甲基化失活也发生在其他原发性人类肿瘤：包括膀胱癌、肺癌、头颈部鳞癌［17，26］。
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