二氮嗪对脑缺血再灌注效果的影响分析-sci医学期刊分类
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ATP依赖性钾通道（KATP）属于内向整流型钾通道，由完全不同的两个亚单位构成，即内向整流亚单 位Kir 61x（Kir611和Kir612）和磺酰脲受体（SUR）两种蛋白质构成［2］。KATP同时存在于细胞膜和线粒体膜上，是一种应激活化分子，缺氧、代谢毒物等均可将其激活，从而调节机体对外界刺激的适应性。其中线 粒体ATP依赖性钾通道（mito KATP）被认为是组织缺血、缺氧保护的共同效应器［1］ 。mito KATP的开放剂能有效地保护缺血再灌注损伤，是减轻缺血损伤和 介导缺血预适应的主要机制 ［3］。mito KATP开放剂二氮嗪原来仅被认为是一种作用于血管内膜钾通道的血管扩张剂，临床上主要用于治疗高血压。
近年来mi- to KATP在脑缺血中的地位引起广泛关注，本实验研究发现，模型组脑组织含水量在12h及1d时间点明显高于二氮嗪组和假手术组，而二氮嗪组高于假手术组，2d时脑含水量模型组高于假手术组，两者之间有统计学意义（ P <0.01），二氮嗪组和假手术组间未见区别，无统计学意义。其余各时间点未见差别。这说明了二氮嗪预处理对深低温缺血再灌注大鼠具有脑保护作用。NR1是NMDAR的基本功能亚单位，NMDAR是 兴奋性神经递质谷氨酸的离子型受体，生理状态下， NMDAR的兴奋对神经系统的发育、学习、记忆起着关键作用，但是在缺血缺氧时，它却是谷氨酸神经毒性的主要通路。谷氨酸是脑内主要的兴奋性氨基酸，但是在一定条件下，也具有神经毒性。缺血缺氧时谷氨酸通过直接和间接两种途径产生兴奋毒性。目前已证实，缺血缺氧时谷氨酸的释放增加，清除减少，突触间 隙的谷氨酸浓度迅速升高，激活NMDAR，产生兴奋毒性。
1 材料和方法
1.1 实验动物
成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，体重200～ 250 g，由南京市儿童医院实验动物中心提供。动物饲 养与实验均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施 细则（1998）》的要求。
1.2 主要仪器与试剂
水合氯醛（南京市儿童医院提供）、二氮嗪（美国Sigma公司）、NR1（Santa Cruz公司），羊抗兔即用型 SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析 系统（江苏捷达）。
1.3 动物模型建立
用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及头部。剃除颈部及腹股沟处鼠毛，碘伏消毒皮肤，酒精脱碘后，纵行剪开颈部皮肤，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口；用涂有石蜡油的温度计插入肛门3cm ，探测大鼠的体温（通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度）。将鼠置冰盒并用冰块袋包埋大鼠行物理降温。当体温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻 断两侧颈总动脉，使体温维持在（21±1） ℃，60min 后恢复颈总动脉血流。用电吹风给大鼠复温，每分钟体 温恢复不超过0.5℃，大约在0.5h内将体温恢复到32℃，再将大鼠放入35℃早产儿孵育箱复温，在2h内将体温恢复到37.5 ℃体温，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。
1.4 动物分组
①假手术组：102只，不夹闭左右颈总动脉，不注 射药物；②模型组：102只，术前腹腔内注射等体积生理盐水；③二氮嗪组：102只，术前腹腔内注射二氮嗪5mg · kg-1。模型组和二氮嗪组再分为缺血60 min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，假手术组分为术后2、6、12 h和1、2、3、7d共7个小组，每个小组 16只，其中6只用于脑组织含水量测定，10只用于石 蜡包埋后行免疫组化检测。
1.5 脑组织含水量测定：待测含水量的脑组织标本测定其湿质量及在电热 恒温干燥箱中100 ℃48h的干质量，以计算含水量。公式如下：含水量=（湿质量-干质量）/湿质量× 100%。
1.6 脑组织中NMDAR1的表达情况
大鼠脑组织予多聚甲醛灌注、固定，完毕后断头取脑，脑组织采用4%多聚甲醛溶液再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。步骤如下：切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内 源性酶，热修复抗原，5%BSA封闭，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗体（1∶100）4℃过夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室温保存20 min，SABC室温20min，滴加新鲜配置的DAB显色液进行显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片后，光镜下观察。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（400×）观察并取其平均值，以灰度值来表示NR1的表达水平，灰度值越高，免疫组织化学染色越浅，NR1表达越低。
1.7 统计学处理
所有实验数据用 x-±s 表示，采用SPSS11.0统计软件进行析因设计资料的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，两两组间均数之间比较采用SNK检验，相同时间点两组间比较用 t 检验，P <0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组大鼠脑组织含水量
结果见表1。3组脑组织含水量在缺血再灌注后2、6h未见明显区别，再灌注12h、1d时3组之间差异有统计学意义（P<0.01），模型组含水量明显高于二氮嗪组和假手术组，二氮嗪组高于假手术组，2d时模 型组和假手术组之间比较差异有统计学意义（ P < 0.01），二氮嗪组和假手术组间差异无统计学意义（P>0.05）。3 d和7d 3组间无统计学差异（P>0.05）。表1 3组大鼠缺血再灌注不同时间脑含水量比较（略）
模型组NR1在2h开始升高，1d达到高峰后下降，7d达到正常水平。二氮嗪组变化与模型组类似，但NR1表达水平低于模型组，假手术组NR1表达水平最低，3组各时间点（除7 d外）均有统计学差异（P <0.05）。3组灰度值见表2（灰度值越高，表明NR1表 达越低）。表2 各组再灌注后NR1的表达情况比较（略）
医学sci期刊目录 http://www.qikanba.com/
ATP依赖性钾通道（KATP）属于内向整流型钾通道，由完全不同的两个亚单位构成，即内向整流亚单 位Kir 61x（Kir611和Kir612）和磺酰脲受体（SUR）两种蛋白质构成［2］。KATP同时存在于细胞膜和线粒体膜上，是一种应激活化分子，缺氧、代谢毒物等均可将其激活，从而调节机体对外界刺激的适应性。其中线 粒体ATP依赖性钾通道（mito KATP）被认为是组织缺血、缺氧保护的共同效应器［1］ 。mito KATP的开放剂能有效地保护缺血再灌注损伤，是减轻缺血损伤和 介导缺血预适应的主要机制 ［3］。mito KATP开放剂二氮嗪原来仅被认为是一种作用于血管内膜钾通道的血管扩张剂，临床上主要用于治疗高血压。
近年来mi- to KATP在脑缺血中的地位引起广泛关注，本实验研究发现，模型组脑组织含水量在12h及1d时间点明显高于二氮嗪组和假手术组，而二氮嗪组高于假手术组，2d时脑含水量模型组高于假手术组，两者之间有统计学意义（ P <0.01），二氮嗪组和假手术组间未见区别，无统计学意义。其余各时间点未见差别。这说明了二氮嗪预处理对深低温缺血再灌注大鼠具有脑保护作用。NR1是NMDAR的基本功能亚单位，NMDAR是 兴奋性神经递质谷氨酸的离子型受体，生理状态下， NMDAR的兴奋对神经系统的发育、学习、记忆起着关键作用，但是在缺血缺氧时，它却是谷氨酸神经毒性的主要通路。谷氨酸是脑内主要的兴奋性氨基酸，但是在一定条件下，也具有神经毒性。缺血缺氧时谷氨酸通过直接和间接两种途径产生兴奋毒性。目前已证实，缺血缺氧时谷氨酸的释放增加，清除减少，突触间 隙的谷氨酸浓度迅速升高，激活NMDAR，产生兴奋毒性。
1 材料和方法
1.1 实验动物
成年健康SD大鼠306只，雌雄不限，体重200～ 250 g，由南京市儿童医院实验动物中心提供。动物饲 养与实验均符合我国卫生部《医学实验动物管理实施 细则（1998）》的要求。
1.2 主要仪器与试剂
水合氯醛（南京市儿童医院提供）、二氮嗪（美国Sigma公司）、NR1（Santa Cruz公司），羊抗兔即用型 SABC免疫组化检测试剂盒SA1022（武汉博士德公司）、DAB显色剂（武汉博士德公司）、多聚赖氨酸（美国Sigma公司）、电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）、荧光倒置显微镜（德国蔡司）、801图像分析 系统（江苏捷达）。
1.3 动物模型建立
用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉后固定大鼠四肢及头部。剃除颈部及腹股沟处鼠毛，碘伏消毒皮肤，酒精脱碘后，纵行剪开颈部皮肤，从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口；用涂有石蜡油的温度计插入肛门3cm ，探测大鼠的体温（通过对大鼠深部体温检测来估计脑部的温度）。将鼠置冰盒并用冰块袋包埋大鼠行物理降温。当体温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻 断两侧颈总动脉，使体温维持在（21±1） ℃，60min 后恢复颈总动脉血流。用电吹风给大鼠复温，每分钟体 温恢复不超过0.5℃，大约在0.5h内将体温恢复到32℃，再将大鼠放入35℃早产儿孵育箱复温，在2h内将体温恢复到37.5 ℃体温，维持正常体温4h后放置室温下正常饲养。
1.4 动物分组
①假手术组：102只，不夹闭左右颈总动脉，不注 射药物；②模型组：102只，术前腹腔内注射等体积生理盐水；③二氮嗪组：102只，术前腹腔内注射二氮嗪5mg · kg-1。模型组和二氮嗪组再分为缺血60 min再灌注后2、6、12h和1、2、3、7d共7个小组，假手术组分为术后2、6、12 h和1、2、3、7d共7个小组，每个小组 16只，其中6只用于脑组织含水量测定，10只用于石 蜡包埋后行免疫组化检测。
1.5 脑组织含水量测定：待测含水量的脑组织标本测定其湿质量及在电热 恒温干燥箱中100 ℃48h的干质量，以计算含水量。公式如下：含水量=（湿质量-干质量）/湿质量× 100%。
1.6 脑组织中NMDAR1的表达情况
大鼠脑组织予多聚甲醛灌注、固定，完毕后断头取脑，脑组织采用4%多聚甲醛溶液再固定约24h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。步骤如下：切片常规脱蜡，3%H2O2灭活内 源性酶，热修复抗原，5%BSA封闭，加入兔抗大鼠NMDAR1多克隆抗体（1∶100）4℃过夜，再滴加生物素化山羊抗兔IgG室温保存20 min，SABC室温20min，滴加新鲜配置的DAB显色液进行显色，苏木素复染，常规脱水，透明，中性树胶封片后，光镜下观察。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野（400×）观察并取其平均值，以灰度值来表示NR1的表达水平，灰度值越高，免疫组织化学染色越浅，NR1表达越低。
1.7 统计学处理
所有实验数据用 x-±s 表示，采用SPSS11.0统计软件进行析因设计资料的方差分析，组间比较采用单因素方差分析，两两组间均数之间比较采用SNK检验，相同时间点两组间比较用 t 检验，P <0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组大鼠脑组织含水量
结果见表1。3组脑组织含水量在缺血再灌注后2、6h未见明显区别，再灌注12h、1d时3组之间差异有统计学意义（P<0.01），模型组含水量明显高于二氮嗪组和假手术组，二氮嗪组高于假手术组，2d时模 型组和假手术组之间比较差异有统计学意义（ P < 0.01），二氮嗪组和假手术组间差异无统计学意义（P>0.05）。3 d和7d 3组间无统计学差异（P>0.05）。表1 3组大鼠缺血再灌注不同时间脑含水量比较（略）
模型组NR1在2h开始升高，1d达到高峰后下降，7d达到正常水平。二氮嗪组变化与模型组类似，但NR1表达水平低于模型组，假手术组NR1表达水平最低，3组各时间点（除7 d外）均有统计学差异（P <0.05）。3组灰度值见表2（灰度值越高，表明NR1表 达越低）。表2 各组再灌注后NR1的表达情况比较（略）
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