x-连锁无丙种球蛋白血症的治疗研究-上海中医药杂志投稿
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1 XLA的治疗研究
免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使之发挥功能，以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接受骨髓移植，总存活率为62%，其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨髓（matched unrelated marrow donor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率约为50%，5岁以内接受移植者可达85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为75%。用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）已有成功的报道［5］。
将正常目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化），随细胞有丝分裂，转化的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗的指针［24］。基因治疗PID的尝试已经历多年，取得一定成效，但尚处于探索和临床验证阶段［25］。Faust等［26］的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTK cDNA转录至两组免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正常量的25%；而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾B细胞，两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低，但较XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通过人类BTK cDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗，纠正了BTK缺陷鼠的B细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达，并在其他组织均有低水平表达。
经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK蛋白总含量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也可对XLA患者有益，为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信，XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。
2. BTK基因的分子结构及其突变分析
在20世纪80年代，多位学者应用DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部（Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表1 编码外显子蛋白突变的区域
3 BTK的分子致病机制
BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并激活phospholipase C -γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据［1，12］。该
信号传导途径受FcRⅡB和SHIP（ SH2-containing inositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括G-protein-coupled receptors（ GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH- TH区域与Gαq和Gβ双体作用；SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用；SH2与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。
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1 XLA的治疗研究
免疫重建是采用正常细胞或基因片段植入患儿体内，使之发挥功能，以持久地纠正缺陷的基因及其表达产物。1968年使用HLA配型同种异体骨髓移植治疗2例致死性免疫缺陷病获得成功。至今已有近2000例PID患儿接受骨髓移植，总存活率为62%，其中同型合子骨髓移植达79%。无关供体配型骨髓（matched unrelated marrow donor，MUD）移植在近年已很盛行，成功率约为50%，5岁以内接受移植者可达85%［23］。近年开展脐血干细胞移植，存活率为75%。用母体骨髓CD34+干细胞宫内移植（腹腔注射）已有成功的报道［5］。
将正常目的基因片段整合到患儿干细胞基因组内（基因转化），随细胞有丝分裂，转化的基因片段能在患儿体内复制而持续存在。理论上讲，凡能通过骨髓移植治愈的疾病均是基因治疗的指针［24］。基因治疗PID的尝试已经历多年，取得一定成效，但尚处于探索和临床验证阶段［25］。Faust等［26］的动物实验是通过免疫球蛋白的增强子和驱动子介导的小鼠BTK cDNA转录至两组免疫缺陷鼠（XLD或BTK-/-鼠）。转入1个拷贝的XLD或BTK-/-鼠经蛋白印迹法检测其BTK达到正常量的25%；而转录2个拷贝者其BTK达到正常量的50%。两组小鼠经检测均有正常数量的脾B细胞，两组小鼠对TNP一蔗聚糖刺激所产生抗体的反应和血清IgM、lgG3水平较正常野生鼠明显减低，但较XID小鼠有所提高。Drabek等［27］通过人类BTK cDNA与鼠主要组织相容性复合体Ⅱ区调节因子的转基因治疗，纠正了BTK缺陷鼠的B细胞功能，并发现转入的基因并不表达于前B细胞以前的分化阶段，此外它在胸腺上皮细胞、活化T细胞、单核细胞上表达，并在其他组织均有低水平表达。
经蛋白印迹法检测转基因鼠的脾细胞产物发现，BTK蛋白总含量可达到与野生型鼠相同。这些研究均向我们提供了基因治疗XLA的可能性。此外，Rohrer等［28］通过动物实验证实，应用极少量正常骨髓细胞输注即可通过竞争使XID小鼠获得B系统免疫重建。这项研究推测，即使不成功的基因治疗也可对XLA患者有益，为今后开展人类XLA的基因、细胞治疗提供有利的基础和广阔的前景。总体上说，尽管目前基因治疗离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已获得了大量宝贵的临床资料。我们有理由相信，XLA的基因治疗将在不久的将来获得突破性进展。
2. BTK基因的分子结构及其突变分析
在20世纪80年代，多位学者应用DNA多态性标志分析的方法，成功地将XLA的缺陷基因定位于X染色体中部（Xq21.3-22）的2cm区域内［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病变基因区内分离鉴定了一个新的基因，该基因表达于正常人各期B淋巴细胞，在XLA患者中发生突变，故认为是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全长37.5kb，含有19个外显子，除第一外显子外，其余18个编码BTK蛋白的659个氨基酸，分子量为76KD［9］。cDNA含有2560个核苷酸，有一个编码659个氨基酸多肽的开放阅读框架，起始密码子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15个密码子处阅读框架闭合。根据国际研究小组BTK突变分析，迄今已经在471个家族544个XLA病人中发现了BTK基因341个独立存在的碱基置换、插入或缺失，其中有13个大段缺失和2个大段插入。突变不仅存在于19个外显子，还涉及内含子和启动区域。其中，发生频率最高的是错义突变，其次是无义突变和拼接位点突变。错义突变主要发生在三联体密码子的前两位。外显子8和9的185~287位没有错义突变，这些位点可能不易突变或是功能上不重要。33%的替代累及CPG双核苷酸，这是目前认为的最常见的突变热点［10］，而突变高频位点R520也属于CPG突变［6］。编码外显子蛋白突变的区域［11］（见表1）。表1 编码外显子蛋白突变的区域
3 BTK的分子致病机制
BTK属于非受体酪氨酸蛋白激酶，该类激酶广泛参与细胞信号传导，影响细胞的存活、增殖和分化，BTK是B细胞发育成熟的关键因素。正常人除T细胞和浆细胞外均有BTK表达，而BTK基因突变只影响B细胞的数量，这说明BTK在B细胞的生长发育过程中起着至关重要的作用。目前对BTK参与细胞信号传导研究比较清楚的是BCR交联介导的信号传导途径。其过程简述如下：BCR交联激活Pl-3激酶并产生一定数量的Pl-3，4，5-risphosphate与膜结合，Pl-3，4，5-risphosphate与BTK的SH3段作用使其定位于细胞膜。然后，BTK经过两步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是与Lyn作用），接着是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK与B细胞衔接蛋白（BLNK）结合并激活phospholipase C -γy（PLC-γ），导致钙离子通道打开，胞外钙离子内流。该信号传导途径最终导致细胞增生加强和转录的变化。此模式仅限于以B细胞受体交联作为刺激信号，至于前B细胞受体交联是否也引起相同的信号传导目前还缺乏证据［1，12］。该
信号传导途径受FcRⅡB和SHIP（ SH2-containing inositol-5-phosphatase）磷酸酶介导的另一途径制约，通过水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate关闭钙离子内流通道［13］。BTK不仅可以由BCR和FCR介导激活，也可以通过其他很多受体激活，包括G-protein-coupled receptors（ GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和单克隆抗体的交联也可激活BTK［13］，近年来研究表明，CD40也是B细胞发育过程中的重要受体，传递刺激信号影响细胞存活、生长和分化。与BCR介导的BTK活化途径相似，CD40的交联也可激活BTK。CD40和BCR可能是B细胞发育过程中不同阶段激活BTK的信号传递通路。但也有研究提示CD40不通过BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是独立于BTK的信号传导通路［14～16］。BTK在细胞内与很多分子相互作用，共同构成了一种微环境，在信号传导的过程中起着重要的作用。这些分子分别与BTK的不同区段相互作用，其中与PH段作用的分子研究得很多，R28附近区域与PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH- TH区域与Gαq和Gβ双体作用；SH3与c-Cb1、WASp、Vav和sab作用；SH2与磷酸化的BLNK作用。另外，SH3与TH在BTK分子内作用，抑制BTK的活性。在BCR交联介导的信号传导途径中，Syk和BLNK对BTK的活化起正向调节作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK对BTK的活化有抑制作用。尽管与BTK作用的分子很多，但是它们如何协调地与BTK作用，完成BTK参与的信号传导，机制目前尚不清楚［17，18］。
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