测定肺炎链球菌全细胞中pBps含量的实验报告-怎样书写医学论文
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本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量，首先需要分离菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/ml。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜（3），使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min,以便除去某些蛋白质的干扰，青霉素与PBPs结合较牢固，不会被破坏。本实验采用SDS一PAGE方法（4-5），SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种肺炎链球菌31003,30301（北京药品生物制品检定所；Pen08.R6本室保存菌种。
1.1.2培养基C+Y培养基，参见文献（2）。
1.1.3仅器及药品
垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪器厂）；NG一l型真空凝胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL一1a型台式高速冷冻离心机（中科院上海生物化学研究所）；8438一超低温冰箱（FormaSclentifi。，美国）；电泳仪DY一1型（上海医用分析仪器厂）；丙烯酞胺（Aerylamide,临海止学厂产）；甲撑双丙烯酞胺。（big;瑞士产品）；N,N,N,N一四甲基乙二胺（TEMED,上海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙酞呱陡盐（NewEngiandNuclear,美国）；x光底片（天津感光材料厂；KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em）；2,5一二苯基嗯哇（PPO,闪烁纯，上海试剂一厂）；月桂酞肌氨酸钠（Sarkosyl,Sigma）；十二烷基硫酸钠（SDs,上海新华化工厂）；二甲基亚矾（DMso,北京旭东化工厂）。
1.2方法
1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37℃过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37℃培养2~3h至对数生长期，菌数约为个/ml（CFU/ml），菌液分装试管，每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml,冷冻离心5000:/minlom仇，弃去上清，菌体沉淀用50以磷酸缓冲液（PH6.8）做成菌悬液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保温10min使细胞溶解，加入30协一样品缓冲液，煮沸3min,置室温备用。
1.2.2聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDSPAGE）方法。制备凝胶薄片（厚0.2cm），凝胶配方：分离胶（10%）：Aerylamide:bis（30:0.5）6.7ml,Tris（pH8.8,1.5ml/ l）5ml,10%SDS 0.2ml,蒸馏水8.1ml,真空搅拌10一15min除去气体，再加入TEMED,浓缩胶（5%）：按上述配方依次为1.7ml,2.5ml,0.1而，5.6ml,7.5,和150。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v,走完全程约需3一4h,用考马斯蓝R250染色30一45min,过夜脱色。
1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾（DMSo）处理30min,再用新鲜DMSo再次处理30而n,20%即。处理2一3h,l%甘油和1%乙酸处理lh,将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一70℃使曝光1~Zwr,将x光底片显影，定影，冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件：（1）国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，x光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离50cm,闪光灯闪二次；（2）进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV,距离40em,每张x光底片曝光0.04s。
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本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量，首先需要分离菌体蛋白，为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上，必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/ml。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜，它能选择性地作用于胞浆膜（3），使胞浆膜破裂，菌体蛋白释放出来，与此同时，已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕，煮沸3min,以便除去某些蛋白质的干扰，青霉素与PBPs结合较牢固，不会被破坏。本实验采用SDS一PAGE方法（4-5），SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种肺炎链球菌31003,30301（北京药品生物制品检定所；Pen08.R6本室保存菌种。
1.1.2培养基C+Y培养基，参见文献（2）。
1.1.3仅器及药品
垂直板凝胶电泳槽（吴县科研仪器厂）；NG一l型真空凝胶干燥器（太仓电视机厂）；TGLL一1a型台式高速冷冻离心机（中科院上海生物化学研究所）；8438一超低温冰箱（FormaSclentifi。，美国）；电泳仪DY一1型（上海医用分析仪器厂）；丙烯酞胺（Aerylamide,临海止学厂产）；甲撑双丙烯酞胺。（big;瑞士产品）；N,N,N,N一四甲基乙二胺（TEMED,上海前进农场制剂厂）；3H标记青霉素乙酞呱陡盐（NewEngiandNuclear,美国）；x光底片（天津感光材料厂；KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em）；2,5一二苯基嗯哇（PPO,闪烁纯，上海试剂一厂）；月桂酞肌氨酸钠（Sarkosyl,Sigma）；十二烷基硫酸钠（SDs,上海新华化工厂）；二甲基亚矾（DMso,北京旭东化工厂）。
1.2方法
1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37℃过夜培养，次日再移种新鲜培养基中，37℃培养2~3h至对数生长期，菌数约为个/ml（CFU/ml），菌液分装试管，每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml,冷冻离心5000:/minlom仇，弃去上清，菌体沉淀用50以磷酸缓冲液（PH6.8）做成菌悬液，然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保温10min使细胞溶解，加入30协一样品缓冲液，煮沸3min,置室温备用。
1.2.2聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDSPAGE）方法。制备凝胶薄片（厚0.2cm），凝胶配方：分离胶（10%）：Aerylamide:bis（30:0.5）6.7ml,Tris（pH8.8,1.5ml/ l）5ml,10%SDS 0.2ml,蒸馏水8.1ml,真空搅拌10一15min除去气体，再加入TEMED,浓缩胶（5%）：按上述配方依次为1.7ml,2.5ml,0.1而，5.6ml,7.5,和150。先配制分离胶，灌注直立式电泳槽后，使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶，放入加样梳，静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流，第一小时维持电压在60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v,走完全程约需3一4h,用考马斯蓝R250染色30一45min,过夜脱色。
1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾（DMSo）处理30min,再用新鲜DMSo再次处理30而n,20%即。处理2一3h,l%甘油和1%乙酸处理lh,将凝胶片贴附在厚滤纸上，使用凝胶真空干燥器进行真空干燥，将凝胶片和x光底片贴紧，置于x光射线暗匣内，放超低温冰箱一70℃使曝光1~Zwr,将x光底片显影，定影，冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件：（1）国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片，加6层红色玻璃纸滤过，x光底片上覆盖6层红色玻璃纸，距离50cm,闪光灯闪二次；（2）进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV,距离40em,每张x光底片曝光0.04s。
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