随机扩增多态性DNA技术测试不同产区半夏的药效分析报告-内科糖尿病护理论文
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1 材料与方法
1.1药材：采自四川、重庆及陕西等地不同地点,共21份。来源详见表1。
1.2 DNA的提取
取每一居群10～15不同单株新鲜叶片约0.3 g,经消毒和洗净后,放在乳钵中加入600 μL氯仿于室温下研磨成匀浆,然后加入1.5 mL SDS抽提液[100 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)；100 mmol/L EDTA(pH 8.0)；0.5 mol/L NaCl；1.5%(W/V) SDS]混匀。将1.2 mL匀浆转移至1.5 mL离心管,室温(>15 ℃)静置10 min。室温下12 000 r/min离心10 min,取上层水相于另一干净1.5 mL离心管,加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)进行抽提,重复抽提2～3次,直到界面清晰为止。取上清液加入到500 μL预冷(4 ℃)无水乙醇中沉淀DNA,此时可见絮状DNA沉淀下来。去上清液,沉淀经70%乙醇洗涤3次,空气中干燥后用TE溶解备用。用紫外分光光度计检测样品DNA浓度,通过计算,稀释到终浓度为50 ng/μL备用。
1.3 RAPD反应
用Sangon公司生产的S系列的100个十聚体随机引物对材料进行扩增筛选,从中共筛选出谱带清晰的引物29个用于试验和统计分析,反应在BIO-RAD 的MyCyclerTM PCR仪上进行。反应总体积25 μL,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2,1 U Taq酶,0.25 μmol/L引物；100 ng模板DNA,dNTPs各0.2 mmol/L。扩增前94 ℃预变性3 min,每循环在94 ℃变性1 min,36 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共45个循环,完成最后一个循环后,在72 ℃保温10 min,然后在4 ℃保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。溴化乙锭染色,凝胶成像仪上观察照像、记录。
2 结果与讨论
随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphism DNA,RAPD)是以PCR为基础的快速简便的分子标记技术,因其费用不高,DNA用量少、不需预知研究对象的基因组序列、PCR引物无种属限制等优点,目前已应用于人参[2]、石斛[3]等药用植物的遗传多样性研究。本研究选取了21个野生半夏居群进行了RAPD-PCR扩增分析,构建遗传聚类树状图对半夏居群间的遗传关系进行了研究,旨在探讨其居群间的遗传关系,为半夏种质资源的保护、合理开发利用和新品种选育提供有价值的资料,也为半夏药材DNA指纹图谱的构建奠定一定的基础。
2.1 扩增片段多态性
RAPD扩增结果表明：29个引物中有28个(96.6%)引物的扩增产物具多态性。图1为引物S20的扩增结果。29个引物共得到162条扩增DNA片段,平均每个引物可获得5.6个DNA片段, 其中123条具有多态性,占75.9%。表明半夏种质资源多态性水平较高,充分体现了半夏不同居群间的遗传多样性。
2.2 遗传相似系数
半夏21个不同居群的遗传相似系数值见表2。从中可见,半夏不同居群间的GS分布较广,范围为0.592 6～0.895 1,说明其遗传背景较复杂,表明其遗传多样性相对较丰富。PT0002居群的半夏与PT0009居群的半夏相似系数最大,高达0.895 1,说明它们的亲缘关系最近。另外,PT0002居群的半夏与PT0054居群的半夏相似系数最小,为0.592 6,说明它们的亲缘关系较远。
2.3 供试材料的聚类分析结果
从聚类图可以看出,在遗传相似系数0.68处,所有材料可以划分成3组,即Ⅰ组：居群PT0001,PT0037,PT0014,PT0026, Ⅲ组：居群PT0030单独成组。其中,Ⅰ组和Ⅱ组又可分为亚组。材料PT0030为陕西省汉中居群,它与其它材料间的亲缘关系较远,故单独成组且在较小的相似性系数处与其它材料聚在一起。可以认为在很大程度上是由于受汉中当地生态环境条件的影响较大,基因型改变较大,因而在聚类图上单独成组。
2.4 RAPD聚类结果与地理分布的关系
根据RAPD遗传相似系数聚成的3类,分析其地理分布情况。利用随机引物对不同物种基因组DNA进行扩增,其多态性表现不同,如野山参为67.6%[2],石斛多态性为91.2%[3]。本研究结果表明半夏种质资源间多态性为75.9%,推测半夏种质资源基因组DNA多态性较高的原因,主要是由于半夏长期生长在不同地理区域,在逐渐适应各自所处环境过程中遗传物质发生了变化,从而形成各具不同遗传特点的类型, 同时也阐明了中国半夏种质资源在分子水平上确实存在遗传差异。总之,不仅半夏不同居群之间具有较丰富的遗传多样性,而且半夏种质资源的各种各样的变异还与地理上的分布呈一定的相关性。由于半夏繁殖主要为无性繁殖,外界环境条件对半夏资源的基因组成和遗传变异影响较大。本研究同时表明,RAPD技术可以作为半夏的品种选育中鉴别和选择亲本的辅助工具,也为半夏类药材的分类鉴定与道地性评价提供了可能的新手段。
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1 材料与方法
1.1药材：采自四川、重庆及陕西等地不同地点,共21份。来源详见表1。
1.2 DNA的提取
取每一居群10～15不同单株新鲜叶片约0.3 g,经消毒和洗净后,放在乳钵中加入600 μL氯仿于室温下研磨成匀浆,然后加入1.5 mL SDS抽提液[100 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)；100 mmol/L EDTA(pH 8.0)；0.5 mol/L NaCl；1.5%(W/V) SDS]混匀。将1.2 mL匀浆转移至1.5 mL离心管,室温(>15 ℃)静置10 min。室温下12 000 r/min离心10 min,取上层水相于另一干净1.5 mL离心管,加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)进行抽提,重复抽提2～3次,直到界面清晰为止。取上清液加入到500 μL预冷(4 ℃)无水乙醇中沉淀DNA,此时可见絮状DNA沉淀下来。去上清液,沉淀经70%乙醇洗涤3次,空气中干燥后用TE溶解备用。用紫外分光光度计检测样品DNA浓度,通过计算,稀释到终浓度为50 ng/μL备用。
1.3 RAPD反应
用Sangon公司生产的S系列的100个十聚体随机引物对材料进行扩增筛选,从中共筛选出谱带清晰的引物29个用于试验和统计分析,反应在BIO-RAD 的MyCyclerTM PCR仪上进行。反应总体积25 μL,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2,1 U Taq酶,0.25 μmol/L引物；100 ng模板DNA,dNTPs各0.2 mmol/L。扩增前94 ℃预变性3 min,每循环在94 ℃变性1 min,36 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共45个循环,完成最后一个循环后,在72 ℃保温10 min,然后在4 ℃保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。溴化乙锭染色,凝胶成像仪上观察照像、记录。
2 结果与讨论
随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphism DNA,RAPD)是以PCR为基础的快速简便的分子标记技术,因其费用不高,DNA用量少、不需预知研究对象的基因组序列、PCR引物无种属限制等优点,目前已应用于人参[2]、石斛[3]等药用植物的遗传多样性研究。本研究选取了21个野生半夏居群进行了RAPD-PCR扩增分析,构建遗传聚类树状图对半夏居群间的遗传关系进行了研究,旨在探讨其居群间的遗传关系,为半夏种质资源的保护、合理开发利用和新品种选育提供有价值的资料,也为半夏药材DNA指纹图谱的构建奠定一定的基础。
2.1 扩增片段多态性
RAPD扩增结果表明：29个引物中有28个(96.6%)引物的扩增产物具多态性。图1为引物S20的扩增结果。29个引物共得到162条扩增DNA片段,平均每个引物可获得5.6个DNA片段, 其中123条具有多态性,占75.9%。表明半夏种质资源多态性水平较高,充分体现了半夏不同居群间的遗传多样性。
2.2 遗传相似系数
半夏21个不同居群的遗传相似系数值见表2。从中可见,半夏不同居群间的GS分布较广,范围为0.592 6～0.895 1,说明其遗传背景较复杂,表明其遗传多样性相对较丰富。PT0002居群的半夏与PT0009居群的半夏相似系数最大,高达0.895 1,说明它们的亲缘关系最近。另外,PT0002居群的半夏与PT0054居群的半夏相似系数最小,为0.592 6,说明它们的亲缘关系较远。
2.3 供试材料的聚类分析结果
从聚类图可以看出,在遗传相似系数0.68处,所有材料可以划分成3组,即Ⅰ组：居群PT0001,PT0037,PT0014,PT0026, Ⅲ组：居群PT0030单独成组。其中,Ⅰ组和Ⅱ组又可分为亚组。材料PT0030为陕西省汉中居群,它与其它材料间的亲缘关系较远,故单独成组且在较小的相似性系数处与其它材料聚在一起。可以认为在很大程度上是由于受汉中当地生态环境条件的影响较大,基因型改变较大,因而在聚类图上单独成组。
2.4 RAPD聚类结果与地理分布的关系
根据RAPD遗传相似系数聚成的3类,分析其地理分布情况。利用随机引物对不同物种基因组DNA进行扩增,其多态性表现不同,如野山参为67.6%[2],石斛多态性为91.2%[3]。本研究结果表明半夏种质资源间多态性为75.9%,推测半夏种质资源基因组DNA多态性较高的原因,主要是由于半夏长期生长在不同地理区域,在逐渐适应各自所处环境过程中遗传物质发生了变化,从而形成各具不同遗传特点的类型, 同时也阐明了中国半夏种质资源在分子水平上确实存在遗传差异。总之,不仅半夏不同居群之间具有较丰富的遗传多样性,而且半夏种质资源的各种各样的变异还与地理上的分布呈一定的相关性。由于半夏繁殖主要为无性繁殖,外界环境条件对半夏资源的基因组成和遗传变异影响较大。本研究同时表明,RAPD技术可以作为半夏的品种选育中鉴别和选择亲本的辅助工具,也为半夏类药材的分类鉴定与道地性评价提供了可能的新手段。
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