马兜铃酸含量的测定方法优化-骨科优质护理服务论文
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1 仪器与试剂
美国科普公司SSI PC3000高效液相色谱仪,Model 500紫外检测器,HORIBA B-212PH计,Anastar色谱工作站。色谱纯试剂购自天津康科德化学试剂厂,分析纯试剂购自山东禹王化学试剂厂。关木通(两年生)采自沈阳药科大学药用植物园,马兜铃酸A对照品购自中国生物制品检定所(批号110746-200204)。
2 供试品溶液的制备
2.1 提取溶剂的选择
现有的研究中,马兜铃酸的提取溶剂多数选择甲醇、乙醇、丙酮或加入一定量的酸来提取,有文献报道,丙酮-10%甲酸提取效率较高。我们也重点考察了该浓度酸及常用溶剂对提取效率的影响。取干燥关木通药材粉末(40目),精密称定30份,各0.5 g,分别加入表1所示溶剂各20 mL,每种溶剂各提取2份,共30份,分别浸泡2 h,超声15 min,过滤,滤液蒸干,残渣以甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,微孔滤膜过滤后,供HPLC测定用。从实验数据看,甲醇、乙醇不适宜对马兜铃酸进行提取,加入酸或醇水溶液,可使马兜铃酸的提取效率显著增加,综合比较各种溶剂,70%甲醇对马兜铃酸的提取效率最高,可以作为马兜铃酸的最优提取溶剂。
2.2 提取方法的选择
①索氏提取法：取0.5 g关木通药材粉末4份,以70%甲醇120 mL分别索氏提取1、2、3.5、5 h,分别测定含量,结果表明3.5 h后峰面积不再增加。②直接加热回流法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25 mL,提取1 h,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取2次,分别得滤液并测定含量。结果表明,关木通提取1次即1 h即提取完全。③超声提取法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25 mL,提取15 min,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取4次,分别得滤液并测定含量,结果表明,关木通重复提取4次即1 h,即提取完全。
3 色谱条件
3.1 流动相对马兜铃酸含量测定的影响
从大量的文献报道来看,马兜铃酸含量测定的流动相一般使用甲醇-水系统[1]、乙腈-水系统[2],另有采用乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5)[3]系统,本试验对不同流动相系统[甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)、乙腈-水-冰醋酸(50∶50∶1)、乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5,25∶75)]进行了比较,见表2。由表2可以看出,3种流动相条件均可与其他成分实现基本分离,理论塔板数也符合定量分析的要求,但在乙腈-水系统下,马兜铃酸计算含量偏低。
3.2 低酸度对色谱分离的影响
由于马兜铃酸属于酸性物质,流动相中加入适量的酸可以改善峰形,但是酸的加入将会影响色谱住的使用寿命,本节探讨不同酸度对马兜铃酸分离的影响,结果见表3。从表3可以看出,甲醇-1%醋酸水溶液流动相条件分离度良好,理论塔板数符合定量分析要求,降低酸度不影响色谱分离,甲醇-1%醋酸水溶液适合作为含量测定的流动相条件。
3.3 痕量分析时色谱条件的选择
仪器及方法的检测限度是进行马兜铃酸痕量分析的重要指标,为确保用药的安全性,要求色谱条件具有较低的检测限。马兜铃酸有4处最大吸收,即224、250、319、390 nm。取配置好的0.05 mg/mL马兜铃酸对照品溶液,采用无限稀释法,流动相选择甲醇-1%醋酸水溶液及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(PH=7.5),并配以不同检测波长进行最低检出限度的考察,结果见表4。根据样品在不同波长下的最低检测限可以看出,样品在390 nm处检测限较高,不适合作为马兜铃酸含量测定时的检测波长,而250 nm及319 nm检测波长下检出限较低(<1 ng),信号相对较高,适合作为含量分析的检测波长。同时,考虑到224 nm检测波长在复杂样品分析时易出现杂质峰干扰,不建议作为含测检测波长。
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1 仪器与试剂
美国科普公司SSI PC3000高效液相色谱仪,Model 500紫外检测器,HORIBA B-212PH计,Anastar色谱工作站。色谱纯试剂购自天津康科德化学试剂厂,分析纯试剂购自山东禹王化学试剂厂。关木通(两年生)采自沈阳药科大学药用植物园,马兜铃酸A对照品购自中国生物制品检定所(批号110746-200204)。
2 供试品溶液的制备
2.1 提取溶剂的选择
现有的研究中,马兜铃酸的提取溶剂多数选择甲醇、乙醇、丙酮或加入一定量的酸来提取,有文献报道,丙酮-10%甲酸提取效率较高。我们也重点考察了该浓度酸及常用溶剂对提取效率的影响。取干燥关木通药材粉末(40目),精密称定30份,各0.5 g,分别加入表1所示溶剂各20 mL,每种溶剂各提取2份,共30份,分别浸泡2 h,超声15 min,过滤,滤液蒸干,残渣以甲醇溶解,定容至10 mL容量瓶中,微孔滤膜过滤后,供HPLC测定用。从实验数据看,甲醇、乙醇不适宜对马兜铃酸进行提取,加入酸或醇水溶液,可使马兜铃酸的提取效率显著增加,综合比较各种溶剂,70%甲醇对马兜铃酸的提取效率最高,可以作为马兜铃酸的最优提取溶剂。
2.2 提取方法的选择
①索氏提取法：取0.5 g关木通药材粉末4份,以70%甲醇120 mL分别索氏提取1、2、3.5、5 h,分别测定含量,结果表明3.5 h后峰面积不再增加。②直接加热回流法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25 mL,提取1 h,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取2次,分别得滤液并测定含量。结果表明,关木通提取1次即1 h即提取完全。③超声提取法：取关木通粉末1份,提取溶剂为70%甲醇25 mL,提取15 min,过滤,滤液进行含量测定,滤渣再重复提取4次,分别得滤液并测定含量,结果表明,关木通重复提取4次即1 h,即提取完全。
3 色谱条件
3.1 流动相对马兜铃酸含量测定的影响
从大量的文献报道来看,马兜铃酸含量测定的流动相一般使用甲醇-水系统[1]、乙腈-水系统[2],另有采用乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5)[3]系统,本试验对不同流动相系统[甲醇-水-冰醋酸(70∶30∶1)、乙腈-水-冰醋酸(50∶50∶1)、乙腈-0.3% (NH4)2CO3(pH=7.5,25∶75)]进行了比较,见表2。由表2可以看出,3种流动相条件均可与其他成分实现基本分离,理论塔板数也符合定量分析的要求,但在乙腈-水系统下,马兜铃酸计算含量偏低。
3.2 低酸度对色谱分离的影响
由于马兜铃酸属于酸性物质,流动相中加入适量的酸可以改善峰形,但是酸的加入将会影响色谱住的使用寿命,本节探讨不同酸度对马兜铃酸分离的影响,结果见表3。从表3可以看出,甲醇-1%醋酸水溶液流动相条件分离度良好,理论塔板数符合定量分析要求,降低酸度不影响色谱分离,甲醇-1%醋酸水溶液适合作为含量测定的流动相条件。
3.3 痕量分析时色谱条件的选择
仪器及方法的检测限度是进行马兜铃酸痕量分析的重要指标,为确保用药的安全性,要求色谱条件具有较低的检测限。马兜铃酸有4处最大吸收,即224、250、319、390 nm。取配置好的0.05 mg/mL马兜铃酸对照品溶液,采用无限稀释法,流动相选择甲醇-1%醋酸水溶液及乙腈-0.3%(NH4)2CO3(PH=7.5),并配以不同检测波长进行最低检出限度的考察,结果见表4。根据样品在不同波长下的最低检测限可以看出,样品在390 nm处检测限较高,不适合作为马兜铃酸含量测定时的检测波长,而250 nm及319 nm检测波长下检出限较低(<1 ng),信号相对较高,适合作为含量分析的检测波长。同时,考虑到224 nm检测波长在复杂样品分析时易出现杂质峰干扰,不建议作为含测检测波长。
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