口服六味地黄丸对细胞分化影响的分析-医药毕业论文
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1 实验材料
1.1 药物及试剂
1.2 动物
健康Wistar大鼠,清洁级,雌雄各半,体重(200±20)g,湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:医动字第0-002号。
2 方法与结果
2.1 六味地黄丸药液的制备
取六味地黄丸200丸(每8丸相当于原药材量3 g),加纯净水约300 mL,搅拌,煮沸,使之完全溶解后,添加纯净水至375 mL,使其药液浓缩至2.0 g/mL(以原药材含量计),供实验用。
2.2 空白及含药血清样品制备
取Wistar大鼠, 雌雄各半,随机分为对照组(A组)和六味地黄丸高(B组)、中(C组)、低(D组)剂量组,每组30只。禁食12 h(自由饮水),按照30 g/kg(以原药材含量计)剂量(相当于临床等效剂量的12倍,临床等效剂量即为人的临床用药量换算成大鼠的等效剂量),分别灌胃给予蒸馏水和六味地黄丸给药样品溶液,1%戊巴比妥钠麻醉,经肝门静脉取血5 mL,离心血液,取上清液过0.22 μm微孔滤膜后用于实验。
2.3 大鼠前脂肪细胞的培养
取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒,pH 7.2缓冲生理盐水(PBS)洗涤,剪成0.5～l mm3大小均匀的小颗粒,以1 000 r/min离心10 min,取上层的纯脂肪颗粒轻轻地铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培养液5～10 mL,塞紧瓶塞,将底面翻转朝上。37 ℃、5% C02培养1～2 h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。
2.4 油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量
用PBS冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1 h,去固定液,加入油红O染色,室温下染色2 h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490 nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(A值)表示,画出时间-A值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚6 d左右,说明酶的出现在先,脂肪出现在后。
2.5 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响
配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清＋胰岛素10 μmol/L＋地塞米松1 μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30 000个/孔接种于96孔培养板中,37 ℃、5% CO2培养5 d,分别加入上述配制的各培养液,再培养5 d。培养结束后, 酶组织化学提取法测定GPDH的活性,紫外分光光度计340 nm波长处观测吸光度值。以吸光度(A值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂肪细胞以30 000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37 ℃、5% CO2培养10 d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5 d。培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1 h,用油红0工作液(2 g/L)染色2 h,用双蒸水充分洗净,培养板放入37 ℃温箱使残余水分蒸发,用异丙醇溶解细胞内油红0,置酶标仪510 nm观测吸光度(A值)。
2.6 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响
配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10 000个/孔接入96孔培养板中,37 ℃、5% C02培养12 h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48 h。将浓度为5 g/L MTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积(1∶9)配成MTT培养液。移出培养液,换上MTT培养液培养4 h,吸干培养液,每孔加100 μL DMSO,混匀后置酶标仪490 nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。
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1 实验材料
1.1 药物及试剂
1.2 动物
健康Wistar大鼠,清洁级,雌雄各半,体重(200±20)g,湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号:医动字第0-002号。
2 方法与结果
2.1 六味地黄丸药液的制备
取六味地黄丸200丸(每8丸相当于原药材量3 g),加纯净水约300 mL,搅拌,煮沸,使之完全溶解后,添加纯净水至375 mL,使其药液浓缩至2.0 g/mL(以原药材含量计),供实验用。
2.2 空白及含药血清样品制备
取Wistar大鼠, 雌雄各半,随机分为对照组(A组)和六味地黄丸高(B组)、中(C组)、低(D组)剂量组,每组30只。禁食12 h(自由饮水),按照30 g/kg(以原药材含量计)剂量(相当于临床等效剂量的12倍,临床等效剂量即为人的临床用药量换算成大鼠的等效剂量),分别灌胃给予蒸馏水和六味地黄丸给药样品溶液,1%戊巴比妥钠麻醉,经肝门静脉取血5 mL,离心血液,取上清液过0.22 μm微孔滤膜后用于实验。
2.3 大鼠前脂肪细胞的培养
取雄性大鼠腹股沟部纯净脂肪颗粒,pH 7.2缓冲生理盐水(PBS)洗涤,剪成0.5～l mm3大小均匀的小颗粒,以1 000 r/min离心10 min,取上层的纯脂肪颗粒轻轻地铺于经培养液润湿的培养瓶壁上。3～5 min后徐徐加入含20%胎牛血清的DMEM/低糖培养液5～10 mL,塞紧瓶塞,将底面翻转朝上。37 ℃、5% C02培养1～2 h,待粘附牢固后,翻转培养瓶做正常培养,每日观察。原代培养区域单层汇合达到约1/2瓶底面积后即可传代,取培养7代以内的大鼠前脂肪细胞用于实验。
2.4 油红O染色提取法测定脂肪细胞内脂肪含量
用PBS冲洗2～3次,加入10%的甲醛缓冲液室温下固定1 h,去固定液,加入油红O染色,室温下染色2 h,去染色剂,以无菌双蒸水冲洗2次,洗去未着色的染料,倒置显微镜下观察,照相。结束后,以异丙醇溶解,490 nm酶标仪下测吸光度,以吸光度(A值)表示,画出时间-A值曲线。结果前脂肪细胞内的脂肪含量在单层形成6～7 d后迅速增加,11 d左右到达高峰,与形态学上的单层汇合后1周左右细胞内出现脂肪颗粒完全吻合。细胞内脂肪含量的增加比GPDH的出现要晚6 d左右,说明酶的出现在先,脂肪出现在后。
2.5 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞分化过程中甘油磷酸脱氢酶的影响
配制大鼠前脂肪细胞分化培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清＋胰岛素10 μmol/L＋地塞米松1 μmol/L.以分化培养液配制不同浓度六味地黄丸含药血清培养液,其终浓度同“2.7”。取第4代的细胞以30 000个/孔接种于96孔培养板中,37 ℃、5% CO2培养5 d,分别加入上述配制的各培养液,再培养5 d。培养结束后, 酶组织化学提取法测定GPDH的活性,紫外分光光度计340 nm波长处观测吸光度值。以吸光度(A值)间接表示酶的活性,6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行统计分析。培养液的配制同“2.7”项,取第3代的大鼠前脂肪细胞以30 000细胞/孔接种入96孔培养板中,于37 ℃、5% CO2培养10 d后,加入“2.7”项配制好的含药培养液,再于同样条件下培养5 d。培养结束后,细胞用10%的甲醛固定1 h,用油红0工作液(2 g/L)染色2 h,用双蒸水充分洗净,培养板放入37 ℃温箱使残余水分蒸发,用异丙醇溶解细胞内油红0,置酶标仪510 nm观测吸光度(A值)。
2.6 六味地黄丸对大鼠前脂肪细胞增殖的影响
配制大鼠前脂肪细胞增殖培养液：DMEM/低糖＋空白大鼠血清,分别与六味地黄丸含药血清共同溶解于培养液中,其终浓度同“2.7”项。取第4代的大鼠前脂肪细胞,以10 000个/孔接入96孔培养板中,37 ℃、5% C02培养12 h。分别加入上述配制的各种含药培养液,再培养48 h。将浓度为5 g/L MTT液与10%空白大鼠血清的DMEM培养液按体积(1∶9)配成MTT培养液。移出培养液,换上MTT培养液培养4 h,吸干培养液,每孔加100 μL DMSO,混匀后置酶标仪490 nm观测吸光度值,观察各浓度含药血清对前脂肪细胞增殖的影响,测定各孔吸光度(A值)。6复孔取平均值。实验数据以x±s表示,进行t检验。
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