不同产区当归药性成分的测定分析-中华口腔医学杂志投稿
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1 仪器与材料
LC-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津),包括LC-10Avp泵、DAD SPD-M10Avp紫外-可见光检测器,C-R6A数据处理机；722G型分光光度计(上海光学仪器厂)。阿魏酸对照品(美国Sigma；St.Louis,MO)；藁本内酯对照品由总后卫生部药检所提供；右旋糖苷(dextran,分子量10000-20000,美国Sigma；St.Louis, MO)。当归采自甘肃岷县、宕昌,云南丽江、中甸,四川宝兴、南平,陕西龙县、平利。经过笔者鉴定为当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels。乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Nova-Pak C18色谱柱(150 mm ×3.9 mm,4 μm),预柱Nova- Pak C18(20 mm×3.9 mm,4 μm)。流动相为乙腈-水(磷酸调至pH 4.0),梯度洗脱,0～10 min,5%～35%乙腈；10～30 min,35%～70%乙腈；30～40 min,70%～5%乙腈。检测波长为284 nm,体积流量为1 mL/min,柱温为室温,进样量20 μL。在上述色谱条件下,阿魏酸、藁本内酯与样品中其它组分色谱峰可达基线分离,相邻色谱峰分离度大于1.5。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备及对照品纯度检查
精密称取阿魏酸、藁本内酯对照品(五氧化二磷减压干燥36 h)适量,加甲醇制成1 mg/mL阿魏酸和2 mg/mL藁本内酯的混合对照品溶液,即得。将混合对照品溶液稀释10倍,备用。吸取混合对照品稀释溶液和空白试剂各20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。除去甲醇溶剂峰后,按峰面积归一化法计算各对照品纯度,2种对照品质量分数均大于99%。另精密称取右旋糖苷(105 ℃干燥至恒重)0.1 g,定容至100 mL量瓶中,得0.1%右旋糖苷储备液。
另精密称当归药粉5.0 g,加水40 mL,加热,沸腾后保持40 min。煎煮2次,过滤,滤液离心,合并2次上清液,冰冻干燥,即得。再精密称取该提取物0.5 g,加水2 mL溶解,再加95%乙醇使其浓度达85%。静置24 h,抽滤。滤饼用70%乙醇洗涤5次,然后溶解在60 ℃水中,2 000 r/min离心5 min,收集上清液,加水定容至100 mL容量瓶中,供测定多糖用。
2.3 线性关系考察
精密吸取阿魏酸、藁本内酯混合对照品稀释液2、4、8、16、32、64 μL,依次注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标,各对照品含量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。另精密吸取右旋糖苷储备液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL分别置100 mL容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀,得各标准溶液系列。精密吸取各标准溶液2.50 mL于10 mL具塞试管中,加入5.00 mL 0.2%蒽酮-浓硫酸显色剂,摇匀,置沸水浴中加热10 min,取出,放至室温,于625 nm波长处进行比色测定。另取2.5 mL蒸馏水同样操作,作空白对照。各对照品的回归方程、相关系数及线性范围(mg/mL)如下：阿魏酸：Y＝2×10-7X＋0.036 2,0.999 4,0.1～1.6；藁本内酯：Y＝4×10-7X－0.013 2,0.999 6,0.8～12.8；右旋糖苷：Y＝6.01×10-3X＋4.71×10-3,0.999 1,0.01～0.11。
2.4 精密度试验
分别精密吸取阿魏酸、藁本内酯对照品稀释液20 μL,重复进样6次,测定峰面积。另取当归总多糖测定样品液2.50 mL,按照样品多糖含量测定方法测定吸收值,重复测定5次。结果阿魏酸、藁本内酯和多糖的精密度RSD分别为1.36%、1.34%、2.21%。
2.5 回收率测定
精密称取2批已知含量的当归样品各5份,分别供测定多糖及阿魏酸、藁本内酯的回收率。其中供测多糖的样品每份5.0 g,测阿魏酸、藁本内酯的样品每份0.5 g。2批样品分别加入右旋糖苷对照品5.0 mg,阿魏酸、藁本内酯对照品各1.0 mg,制备供试品溶液,按“样品含量测定”项下各对照品测定法操作,测定各对照品含量,计算回收率。各对照品平均回收率(%)分别为：右旋糖苷97.12,阿魏酸97.83,藁本内酯97.82。其RSD分别为2.39%、1.23%、2.13%。
中华医学杂志投稿须知 http://www.qikanba.com/
1 仪器与材料
LC-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津),包括LC-10Avp泵、DAD SPD-M10Avp紫外-可见光检测器,C-R6A数据处理机；722G型分光光度计(上海光学仪器厂)。阿魏酸对照品(美国Sigma；St.Louis,MO)；藁本内酯对照品由总后卫生部药检所提供；右旋糖苷(dextran,分子量10000-20000,美国Sigma；St.Louis, MO)。当归采自甘肃岷县、宕昌,云南丽江、中甸,四川宝兴、南平,陕西龙县、平利。经过笔者鉴定为当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels。乙腈为色谱纯,其它试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Nova-Pak C18色谱柱(150 mm ×3.9 mm,4 μm),预柱Nova- Pak C18(20 mm×3.9 mm,4 μm)。流动相为乙腈-水(磷酸调至pH 4.0),梯度洗脱,0～10 min,5%～35%乙腈；10～30 min,35%～70%乙腈；30～40 min,70%～5%乙腈。检测波长为284 nm,体积流量为1 mL/min,柱温为室温,进样量20 μL。在上述色谱条件下,阿魏酸、藁本内酯与样品中其它组分色谱峰可达基线分离,相邻色谱峰分离度大于1.5。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备及对照品纯度检查
精密称取阿魏酸、藁本内酯对照品(五氧化二磷减压干燥36 h)适量,加甲醇制成1 mg/mL阿魏酸和2 mg/mL藁本内酯的混合对照品溶液,即得。将混合对照品溶液稀释10倍,备用。吸取混合对照品稀释溶液和空白试剂各20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图。除去甲醇溶剂峰后,按峰面积归一化法计算各对照品纯度,2种对照品质量分数均大于99%。另精密称取右旋糖苷(105 ℃干燥至恒重)0.1 g,定容至100 mL量瓶中,得0.1%右旋糖苷储备液。
另精密称当归药粉5.0 g,加水40 mL,加热,沸腾后保持40 min。煎煮2次,过滤,滤液离心,合并2次上清液,冰冻干燥,即得。再精密称取该提取物0.5 g,加水2 mL溶解,再加95%乙醇使其浓度达85%。静置24 h,抽滤。滤饼用70%乙醇洗涤5次,然后溶解在60 ℃水中,2 000 r/min离心5 min,收集上清液,加水定容至100 mL容量瓶中,供测定多糖用。
2.3 线性关系考察
精密吸取阿魏酸、藁本内酯混合对照品稀释液2、4、8、16、32、64 μL,依次注入高效液相色谱仪,按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标,各对照品含量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。另精密吸取右旋糖苷储备液0.10、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL分别置100 mL容量瓶中,加水定容至刻度,摇匀,得各标准溶液系列。精密吸取各标准溶液2.50 mL于10 mL具塞试管中,加入5.00 mL 0.2%蒽酮-浓硫酸显色剂,摇匀,置沸水浴中加热10 min,取出,放至室温,于625 nm波长处进行比色测定。另取2.5 mL蒸馏水同样操作,作空白对照。各对照品的回归方程、相关系数及线性范围(mg/mL)如下：阿魏酸：Y＝2×10-7X＋0.036 2,0.999 4,0.1～1.6；藁本内酯：Y＝4×10-7X－0.013 2,0.999 6,0.8～12.8；右旋糖苷：Y＝6.01×10-3X＋4.71×10-3,0.999 1,0.01～0.11。
2.4 精密度试验
分别精密吸取阿魏酸、藁本内酯对照品稀释液20 μL,重复进样6次,测定峰面积。另取当归总多糖测定样品液2.50 mL,按照样品多糖含量测定方法测定吸收值,重复测定5次。结果阿魏酸、藁本内酯和多糖的精密度RSD分别为1.36%、1.34%、2.21%。
2.5 回收率测定
精密称取2批已知含量的当归样品各5份,分别供测定多糖及阿魏酸、藁本内酯的回收率。其中供测多糖的样品每份5.0 g,测阿魏酸、藁本内酯的样品每份0.5 g。2批样品分别加入右旋糖苷对照品5.0 mg,阿魏酸、藁本内酯对照品各1.0 mg,制备供试品溶液,按“样品含量测定”项下各对照品测定法操作,测定各对照品含量,计算回收率。各对照品平均回收率(%)分别为：右旋糖苷97.12,阿魏酸97.83,藁本内酯97.82。其RSD分别为2.39%、1.23%、2.13%。
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