滋阴补肾丸对广防己的减毒作用及机理研究-浙江医学投稿
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国内外学者现已公认,广防己的肾毒性与其所含主要成分马兜铃酸有关,而其中马兜铃酸A为主要毒性成分[1],且含量较大,故将马兜铃酸A作为测试指标。广防己祛风止痛、清热利水,主治湿热身痛、风湿痹痛、下肢水肿、小便不利等症[2]。湿热之邪极易伤阴,同时广防己利水亦易伤阴。故需配伍养阴药,使邪正兼顾。肾阴为一身阴津之根,滋阴补肾丸为中医滋补肾阴的代表方剂,滋补肾阴,增强正气,既能补已伤之阴液,又能防阴液之再耗。其滋阴之作用,恰恰能制约广防己的利水伤阴之性。因而滋阴补肾丸能够降低广防己利水伤阴的不良反应。
1 实验材料
1.1 仪器
日立L6000型高效液相色谱系统,包括L-4200H UV-VIS Detector D-2500型色谱数据处理仪。MA240D电子分析天平,上海第二天平仪厂。GQ7OE-5型红外快速干燥箱,上海市吴淞五金厂。数显恒温水浴锅,金坛市大地自动化仪器厂。
1.2 药物
广防己,为马兜铃科植物广防己Aristolochi fangchi Y.的干燥根,购自中国药品生物制品检定所,批号919-9001。滋阴补肾丸(浓缩丸),甘肃省河西制药有限公司生产,批号060601。
1.3 试剂
马兜铃酸A对照品(aristolochic acid A,以下简称AA-Ⅰ),由中国药品生物制品检定所提供,批号110746-200406。甲醇、乙腈为色谱纯,山东省禹王实业总公司禹王化工厂产品；无水乙醇、冰醋酸为分析醇,购于安徽医药公司。水为纯化水。
1.4 色谱条件
色谱柱：依利特Hypersil ODS25(4.6 mm×250 mm),柱号为E：1417177；流速：1 mL/min；柱温：室温；检测波长：250 nm；进样量：10 μL；流动相：乙腈-(水＋冰醋酸)＝48∶52,其中,水-冰醋酸＝62.5∶1。理论塔板数不低于2 000。
2 方法与结果
2.1 标准溶液的制备
称取AA-Ⅰ对照品7 mg,置于50 mL量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.14 mg/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液2.0 mL于10 mL量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,摇匀,即得浓度为0.028 mg/mL的AA-Ⅰ对照品溶液。
2.2 供试液的制备
2.2.1 广防己样品溶液的制备
精密称取广防己样品0.6 g,置于200 mL烧杯中,加120 mL自来水,煎煮30 min,过滤,收集滤液,残渣加80 mL自来水,煎煮30 min,过滤,收集滤液,合并两次滤液,置于水浴上,浓缩至干。用适量的无水乙醇溶解并完全转移至10 mL的量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀。放入冰箱冷藏,静置过夜。抽取上清液,过滤,弃去初滤液,收集续滤液,放入1 mL塑料离心管中,作为供试液1。
2.2.2 广防己与滋阴补肾丸供试液的制备
分别取广防己样品、滋阴补肾丸粉末少许,各精密称取0.6 g,置于200 mL烧杯中,混合两种药物,加入120 mL自来水,按“2.2.1”项下制备广防己样品溶液的方法进行操作,其制备液作为供试液2。
2.3 马兜铃酸A对照品的定性分析
分别吸取供试液1和对照品溶液,注入液相色谱仪,按“1.4”项下色谱条件,测绘其色谱图。色谱图见图1。
2.4 标准曲线的制备
精密吸取对照品储备液1、2、3、4、5、6 mL,分别置10 mL的量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度。按“1.4”项下的色谱条件,依次进样测定,测得AA-Ⅰ的峰面积。以AA-Ⅰ的进样量(μg)为横坐标,以对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。由标准曲线可知,在0.08～0.40 μg之间,进样量与峰面积之间呈良好的线性关系,回归方程为：Y＝1.7×105X＋5 248,r＝0.999 9。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μL,按“1.4”项下的色谱条件,注入液相色谱仪,测定对照品溶液的峰面积,平行测定5次。结果RSD＝0.45%,表明精密度良好。按“1.4”项下色谱条件,精密吸取10 μL供试液1,注入液相色谱仪,测定,然后于2、4、8、12、24 h各测定1次,结果RSD＝0.10%,表明供试品溶液在24 h内测定结果稳定。
2.9 马兜铃酸A对照品的定量分析
分别取供试液1、2,按“1.4”项下色谱条件测定并计算各样品中AA-Ⅰ的含量。结果表明,广防己与滋阴补肾丸共煎后,AA-Ⅰ含量降低了30.04%,可见,滋阴补肾丸可以明显降低广防己中AA-Ⅰ的含量。
中国民康医学投稿须知 http://www.qikanba.com/
国内外学者现已公认,广防己的肾毒性与其所含主要成分马兜铃酸有关,而其中马兜铃酸A为主要毒性成分[1],且含量较大,故将马兜铃酸A作为测试指标。广防己祛风止痛、清热利水,主治湿热身痛、风湿痹痛、下肢水肿、小便不利等症[2]。湿热之邪极易伤阴,同时广防己利水亦易伤阴。故需配伍养阴药,使邪正兼顾。肾阴为一身阴津之根,滋阴补肾丸为中医滋补肾阴的代表方剂,滋补肾阴,增强正气,既能补已伤之阴液,又能防阴液之再耗。其滋阴之作用,恰恰能制约广防己的利水伤阴之性。因而滋阴补肾丸能够降低广防己利水伤阴的不良反应。
1 实验材料
1.1 仪器
日立L6000型高效液相色谱系统,包括L-4200H UV-VIS Detector D-2500型色谱数据处理仪。MA240D电子分析天平,上海第二天平仪厂。GQ7OE-5型红外快速干燥箱,上海市吴淞五金厂。数显恒温水浴锅,金坛市大地自动化仪器厂。
1.2 药物
广防己,为马兜铃科植物广防己Aristolochi fangchi Y.的干燥根,购自中国药品生物制品检定所,批号919-9001。滋阴补肾丸(浓缩丸),甘肃省河西制药有限公司生产,批号060601。
1.3 试剂
马兜铃酸A对照品(aristolochic acid A,以下简称AA-Ⅰ),由中国药品生物制品检定所提供,批号110746-200406。甲醇、乙腈为色谱纯,山东省禹王实业总公司禹王化工厂产品；无水乙醇、冰醋酸为分析醇,购于安徽医药公司。水为纯化水。
1.4 色谱条件
色谱柱：依利特Hypersil ODS25(4.6 mm×250 mm),柱号为E：1417177；流速：1 mL/min；柱温：室温；检测波长：250 nm；进样量：10 μL；流动相：乙腈-(水＋冰醋酸)＝48∶52,其中,水-冰醋酸＝62.5∶1。理论塔板数不低于2 000。
2 方法与结果
2.1 标准溶液的制备
称取AA-Ⅰ对照品7 mg,置于50 mL量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为0.14 mg/mL的对照品储备液。精密量取对照品储备液2.0 mL于10 mL量瓶中,用无水乙醇定容至刻度,摇匀,即得浓度为0.028 mg/mL的AA-Ⅰ对照品溶液。
2.2 供试液的制备
2.2.1 广防己样品溶液的制备
精密称取广防己样品0.6 g,置于200 mL烧杯中,加120 mL自来水,煎煮30 min,过滤,收集滤液,残渣加80 mL自来水,煎煮30 min,过滤,收集滤液,合并两次滤液,置于水浴上,浓缩至干。用适量的无水乙醇溶解并完全转移至10 mL的量瓶中,加无水乙醇至刻度,摇匀。放入冰箱冷藏,静置过夜。抽取上清液,过滤,弃去初滤液,收集续滤液,放入1 mL塑料离心管中,作为供试液1。
2.2.2 广防己与滋阴补肾丸供试液的制备
分别取广防己样品、滋阴补肾丸粉末少许,各精密称取0.6 g,置于200 mL烧杯中,混合两种药物,加入120 mL自来水,按“2.2.1”项下制备广防己样品溶液的方法进行操作,其制备液作为供试液2。
2.3 马兜铃酸A对照品的定性分析
分别吸取供试液1和对照品溶液,注入液相色谱仪,按“1.4”项下色谱条件,测绘其色谱图。色谱图见图1。
2.4 标准曲线的制备
精密吸取对照品储备液1、2、3、4、5、6 mL,分别置10 mL的量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度。按“1.4”项下的色谱条件,依次进样测定,测得AA-Ⅰ的峰面积。以AA-Ⅰ的进样量(μg)为横坐标,以对应的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。由标准曲线可知,在0.08～0.40 μg之间,进样量与峰面积之间呈良好的线性关系,回归方程为：Y＝1.7×105X＋5 248,r＝0.999 9。
2.5 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 μL,按“1.4”项下的色谱条件,注入液相色谱仪,测定对照品溶液的峰面积,平行测定5次。结果RSD＝0.45%,表明精密度良好。按“1.4”项下色谱条件,精密吸取10 μL供试液1,注入液相色谱仪,测定,然后于2、4、8、12、24 h各测定1次,结果RSD＝0.10%,表明供试品溶液在24 h内测定结果稳定。
2.9 马兜铃酸A对照品的定量分析
分别取供试液1、2,按“1.4”项下色谱条件测定并计算各样品中AA-Ⅰ的含量。结果表明,广防己与滋阴补肾丸共煎后,AA-Ⅰ含量降低了30.04%,可见,滋阴补肾丸可以明显降低广防己中AA-Ⅰ的含量。
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