更年康颗粒中芍药苷、黄芪甲苷含量测定实验报告-华西药学杂志投稿
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1 仪器与试药
LC-10ADvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-6AV紫外检测器(日本岛津公司)；美国Alltech公司500型蒸发光散射检测器；HW-2000色谱工作站；电子天平(Mettler Toledo AG285)；KQ-500E型医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110736- 200526)；黄芪甲苷对照品；中药材购自南京市药材公司,经南京中医药大学药学院生药教研室鉴定为符合2005版《中华人民共和国药典》规定药材。甲醇为色谱纯,其余所用试剂均为分析纯,均购自上海化学试剂有限公司；水为重蒸水(自制)。
2 方法与结果
2.1 正交设计
当处方中有多味药材时,其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差,用不同种类的成分作为评判指标其结果才有较广泛的代表性。但由于不同药材中的成分含量有时不在同一数量级,直接累加则使数量级大的对结果的贡献大,而小的贡献小,常不符合组方原则及治则。用多指标正交试验进行工艺优选时,首先需解决指标间量纲不一致和指标间的相容与否的问题,然后需针对指标间的重要性差异给出各指标权重,综合评分后再进行统计分析。
方中白芍为君药,其活性成分为芍药苷,可溶于醇类；黄芪、合欢皮主要成分为皂苷和多糖类物质,且这两部分均为活性成分,工艺中采用醇提取,可兼顾两部分成分；钩藤主要活性成分为各种吲哚类生物碱,主要有钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛因碱等,其在乙醇中有较好的溶解性,为充分提高生物碱的利用率,采用醇回流提取。故根据方中这4味药的主要化学成分的理化性质,以乙醇为提取溶媒,采用L9(34)正交表进行正交设计,对乙醇的浓度(B)、用量(A)、提取次数(C)、提取时间(D),用4因素3水平进行考察,以芍药苷、黄芪甲苷含量为考察指标,进行提取工艺最佳参数的确定。其提取工艺因素水平设计见表1。按处方配比取处方药材9份,每份45 g,按照因素水平表操作,加入乙醇,加热回流,过滤后将所得的滤液减压浓缩成稠膏。
2.2 考察指标的测定
2.2.1 HPLC法测定芍药苷含量
色谱条件：采用依利特Hypersil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。
线性关系考察：精密吸取0.601 mg/mL芍药苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分别置于5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,使浓度分别为0.060 1、0.120 2、0.180 3、0.240 4、0.300 5 mg/mL。分别吸取上述各对照品溶液20 μL,进样,按上述色谱条件测定峰面积值,以峰面积均值(Y )为纵坐标,进样浓度(X )为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程：Y＝6 223 541.78X＋38 695.056,r＝0.999 8(n＝5)。结果表明,芍药苷在0.060 1～0.300 5 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约0.2 g,精密称定,置离心管中,精密加入稀乙醇20 mL,称定重量,超声处理1 h,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得芍药苷供试品溶液。吸取20 μL,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点法计算,测定各样品中的芍药苷含量。结果见表2。
2.2.2 HPLC-ELSD测定黄芪甲苷含量
含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约4 g,精密称定,加水10 mL,超声溶解30 min,用水饱和正丁醇振摇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 mL,弃去氨试液,正丁醇液蒸干。残渣加蒸馏水5 mL使溶解,放冷,通过D101型大孔树脂柱(内径1.5 cm,长12 cm),以水50 mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 mL洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中,甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点对数方程法计算,测定各样品中的黄芪甲苷含量。结果见表2。
2.3 实验结果
取处方药材3份,根据筛选得到的提取工艺A2B3C3D2,进行正交验证试验,得芍药苷含量为1.51%,RSD＝1.51%(n＝3)；黄芪甲苷含量为0.061%,RSD＝1.97%(n＝3)。可见,按优化工艺进行提取,芍药苷、黄芪甲苷均取得较理想的结果。表明该工艺稳定可行。
中华精神科杂志投稿 http://www.qikanba.com/
1 仪器与试药
LC-10ADvp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；SPD-6AV紫外检测器(日本岛津公司)；美国Alltech公司500型蒸发光散射检测器；HW-2000色谱工作站；电子天平(Mettler Toledo AG285)；KQ-500E型医用超声清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所,批号110736- 200526)；黄芪甲苷对照品；中药材购自南京市药材公司,经南京中医药大学药学院生药教研室鉴定为符合2005版《中华人民共和国药典》规定药材。甲醇为色谱纯,其余所用试剂均为分析纯,均购自上海化学试剂有限公司；水为重蒸水(自制)。
2 方法与结果
2.1 正交设计
当处方中有多味药材时,其制剂工艺的评价如采用单一指标则代表性较差,用不同种类的成分作为评判指标其结果才有较广泛的代表性。但由于不同药材中的成分含量有时不在同一数量级,直接累加则使数量级大的对结果的贡献大,而小的贡献小,常不符合组方原则及治则。用多指标正交试验进行工艺优选时,首先需解决指标间量纲不一致和指标间的相容与否的问题,然后需针对指标间的重要性差异给出各指标权重,综合评分后再进行统计分析。
方中白芍为君药,其活性成分为芍药苷,可溶于醇类；黄芪、合欢皮主要成分为皂苷和多糖类物质,且这两部分均为活性成分,工艺中采用醇提取,可兼顾两部分成分；钩藤主要活性成分为各种吲哚类生物碱,主要有钩藤碱、异钩藤碱、柯诺辛因碱等,其在乙醇中有较好的溶解性,为充分提高生物碱的利用率,采用醇回流提取。故根据方中这4味药的主要化学成分的理化性质,以乙醇为提取溶媒,采用L9(34)正交表进行正交设计,对乙醇的浓度(B)、用量(A)、提取次数(C)、提取时间(D),用4因素3水平进行考察,以芍药苷、黄芪甲苷含量为考察指标,进行提取工艺最佳参数的确定。其提取工艺因素水平设计见表1。按处方配比取处方药材9份,每份45 g,按照因素水平表操作,加入乙醇,加热回流,过滤后将所得的滤液减压浓缩成稠膏。
2.2 考察指标的测定
2.2.1 HPLC法测定芍药苷含量
色谱条件：采用依利特Hypersil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(25∶75)；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃。
线性关系考察：精密吸取0.601 mg/mL芍药苷对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分别置于5 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,使浓度分别为0.060 1、0.120 2、0.180 3、0.240 4、0.300 5 mg/mL。分别吸取上述各对照品溶液20 μL,进样,按上述色谱条件测定峰面积值,以峰面积均值(Y )为纵坐标,进样浓度(X )为横坐标,绘制标准曲线。得回归方程：Y＝6 223 541.78X＋38 695.056,r＝0.999 8(n＝5)。结果表明,芍药苷在0.060 1～0.300 5 mg/mL范围内呈良好的线性关系。
含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约0.2 g,精密称定,置离心管中,精密加入稀乙醇20 mL,称定重量,超声处理1 h,再称定重量,用稀乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得芍药苷供试品溶液。吸取20 μL,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点法计算,测定各样品中的芍药苷含量。结果见表2。
2.2.2 HPLC-ELSD测定黄芪甲苷含量
含量测定：取按各提取工艺制备的稠膏约4 g,精密称定,加水10 mL,超声溶解30 min,用水饱和正丁醇振摇提取4次,每次40 mL,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40 mL,弃去氨试液,正丁醇液蒸干。残渣加蒸馏水5 mL使溶解,放冷,通过D101型大孔树脂柱(内径1.5 cm,长12 cm),以水50 mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30 mL洗脱,弃去40%乙醇洗脱液,继用70%乙醇50 mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,用甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中,甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,注入液相色谱仪,每个样品平行进样2次,以外标两点对数方程法计算,测定各样品中的黄芪甲苷含量。结果见表2。
2.3 实验结果
取处方药材3份,根据筛选得到的提取工艺A2B3C3D2,进行正交验证试验,得芍药苷含量为1.51%,RSD＝1.51%(n＝3)；黄芪甲苷含量为0.061%,RSD＝1.97%(n＝3)。可见,按优化工艺进行提取,芍药苷、黄芪甲苷均取得较理想的结果。表明该工艺稳定可行。
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