关于止痢宁片的药性成分含量测试-中国康复医学杂志投稿
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1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪：AgilentG1311A四元泵(Quatpump),Agilent G1322A真空在线脱气机(Degrasser), Agilent G1313A自动进样器(ALS),Agilent G1315B DAD二极管阵列检测器,Agilent chimstation system(安捷伦化学工作站)；电子天平(德国赛多利斯BP211D)；超声提取器；Milipore－Q纯水器。止痢宁片自制。三氯甲烷为分析纯；甲醇为色谱纯,美国天地(TEDIA)试剂公司；水为重蒸馏水。对照品均由中国药品生物制品检定所提供：脱水穿心莲内酯对照品；苦参碱；木香烃内酯；去氢木香内酯。
2 定性研究
2.1 苦参薄层色谱鉴别
取本品5片,研细,取1g,加浓氨试液0.3 mL、三氯甲烷25 mL,超声处理10 min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1 mL使溶解,作为供试品溶液。取缺苦参的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取苦参碱对照品、槐定碱对照品,分别加乙醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述4种溶液各5 μL,分别点样于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-浓氨(9∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。
2.2 木香薄层色谱鉴别
取本品5片,研细,取1 g,加三氯甲烷10 mL,超声处理30 min,滤过,滤液作为供试品溶液。取缺木香的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品,分别加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述4种溶液各10 μL,分别点于同一含2.5%硝酸银的羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-丙酮(8∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性无干扰。
3 含量测定[1]
3.1 色谱条件
色谱柱为YWG C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：室温；流动相：甲醇-水(52∶48)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。在上述条件下,脱水穿心莲内酯的保留时间约为15 min；分离度大于1.5,理论塔板数大于4 000。
3.2 对照品溶液的配制
精密称取脱水穿心莲内酯标准品3.10 mg,置25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取止痢宁片适量,研细,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10 mL,置中性氧化铝柱(100～200目,5 g,内径1.5 cm)上,用甲醇15 mL洗脱,收集洗脱液,置50 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,滤液作为供试品溶液。
3.4 线性关系考察
精密吸取脱水穿心莲内酯标准品溶液10 mL,用水稀释1倍(62 μg/mL),分别进样1、2.5、5、10、15、20、25 μL,依前法测定。以脱水穿心莲内酯的量(μg)为横坐标,峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y＝1 359.5X＋0.315 4,相关系数r＝1.000 0。表明脱水穿心莲内酯在0.062～1.55 μg范围内进样量与峰面积值有较好的线性关系。
3.5 试验
精密吸取“3.5”项所述对照品溶液10 μL,重复进样6次,结果峰面积值的RSD＝0.20%。按“3.3”项下方法制备溶液,分别在0、2.5、5、7、9.5、11.5 h进样,分别测定,记录峰面积积分值。结果表明,脱水穿心莲内酯峰面积在11.5 h内基本不变,RSD＝0.33%。取同一批样品(批号20060601)5份,各约1 g,精密称定,分别按“3.3”项下方法操作,进行测定。结果脱水穿心莲内酯的平均含量为7.46 mg/g,RSD＝0.41%。分别取已知含量的样品(批号20060601)5份,各约0.5 g,精密称定,分别精密添加脱水穿心莲内酯对照品3.71 mg,按“3.3”项下方法处理,按上述条件进行测定,结果见表1。
3.6 样品测定
取止痢宁片3批,分别按“3.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样测定,外标法定量,结果见表2。 在含量测定方法中,我们对供试品溶液制备的关键步骤进行了考察：①供试品超声时间的选择：对不同超声时间的样品回收率,以及药渣中脱水穿心莲内酯的含量进行了比较,确定超声30 min最佳。②最佳洗脱体积的选择：分别对10、15 mL甲醇洗脱后的柱子继续洗脱,检测其中的脱水穿心莲内酯,结果15 mL甲醇洗脱后没有检测出脱水穿心莲内酯,认为最佳洗脱体积为15 mL。
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1 仪器与试药
Agilent 1100高效液相色谱仪：AgilentG1311A四元泵(Quatpump),Agilent G1322A真空在线脱气机(Degrasser), Agilent G1313A自动进样器(ALS),Agilent G1315B DAD二极管阵列检测器,Agilent chimstation system(安捷伦化学工作站)；电子天平(德国赛多利斯BP211D)；超声提取器；Milipore－Q纯水器。止痢宁片自制。三氯甲烷为分析纯；甲醇为色谱纯,美国天地(TEDIA)试剂公司；水为重蒸馏水。对照品均由中国药品生物制品检定所提供：脱水穿心莲内酯对照品；苦参碱；木香烃内酯；去氢木香内酯。
2 定性研究
2.1 苦参薄层色谱鉴别
取本品5片,研细,取1g,加浓氨试液0.3 mL、三氯甲烷25 mL,超声处理10 min,滤过,滤液蒸干,残渣加三氯甲烷1 mL使溶解,作为供试品溶液。取缺苦参的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取苦参碱对照品、槐定碱对照品,分别加乙醇制成每1 mL各含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述4种溶液各5 μL,分别点样于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇-浓氨(9∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以稀碘化铋钾试液。供试品色谱中,在与对照品色谱相应位置上,显相同颜色的斑点。
2.2 木香薄层色谱鉴别
取本品5片,研细,取1 g,加三氯甲烷10 mL,超声处理30 min,滤过,滤液作为供试品溶液。取缺木香的阴性样品,同法制成阴性对照溶液。另取木香烃内酯对照品、去氢木香内酯对照品,分别加三氯甲烷制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录ⅥB]试验,吸取上述4种溶液各10 μL,分别点于同一含2.5%硝酸银的羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上,以环己烷-乙酸乙酯-丙酮(8∶1∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,喷以5%香草醛硫酸溶液,加热至斑点显色清晰。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,且阴性无干扰。
3 含量测定[1]
3.1 色谱条件
色谱柱为YWG C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：室温；流动相：甲醇-水(52∶48)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。在上述条件下,脱水穿心莲内酯的保留时间约为15 min；分离度大于1.5,理论塔板数大于4 000。
3.2 对照品溶液的配制
精密称取脱水穿心莲内酯标准品3.10 mg,置25 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,即得对照品溶液。
3.3 供试品溶液的制备
取止痢宁片适量,研细,取约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加甲醇25 mL,称定重量,超声处理(功率250 W,频率33 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10 mL,置中性氧化铝柱(100～200目,5 g,内径1.5 cm)上,用甲醇15 mL洗脱,收集洗脱液,置50 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 μm)滤过,滤液作为供试品溶液。
3.4 线性关系考察
精密吸取脱水穿心莲内酯标准品溶液10 mL,用水稀释1倍(62 μg/mL),分别进样1、2.5、5、10、15、20、25 μL,依前法测定。以脱水穿心莲内酯的量(μg)为横坐标,峰面积值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程Y＝1 359.5X＋0.315 4,相关系数r＝1.000 0。表明脱水穿心莲内酯在0.062～1.55 μg范围内进样量与峰面积值有较好的线性关系。
3.5 试验
精密吸取“3.5”项所述对照品溶液10 μL,重复进样6次,结果峰面积值的RSD＝0.20%。按“3.3”项下方法制备溶液,分别在0、2.5、5、7、9.5、11.5 h进样,分别测定,记录峰面积积分值。结果表明,脱水穿心莲内酯峰面积在11.5 h内基本不变,RSD＝0.33%。取同一批样品(批号20060601)5份,各约1 g,精密称定,分别按“3.3”项下方法操作,进行测定。结果脱水穿心莲内酯的平均含量为7.46 mg/g,RSD＝0.41%。分别取已知含量的样品(批号20060601)5份,各约0.5 g,精密称定,分别精密添加脱水穿心莲内酯对照品3.71 mg,按“3.3”项下方法处理,按上述条件进行测定,结果见表1。
3.6 样品测定
取止痢宁片3批,分别按“3.3”项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件进样测定,外标法定量,结果见表2。 在含量测定方法中,我们对供试品溶液制备的关键步骤进行了考察：①供试品超声时间的选择：对不同超声时间的样品回收率,以及药渣中脱水穿心莲内酯的含量进行了比较,确定超声30 min最佳。②最佳洗脱体积的选择：分别对10、15 mL甲醇洗脱后的柱子继续洗脱,检测其中的脱水穿心莲内酯,结果15 mL甲醇洗脱后没有检测出脱水穿心莲内酯,认为最佳洗脱体积为15 mL。
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