中药辅助治疗对糖尿病蛋白激酶Cβ亚型影响的研究-四川中医杂志投稿
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1 实验材料
1.1动物
8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠65只,体重250～280 g,,许可证号SCXK(沪) 2003-003。
1.2 药物
加味补肝汤(枸杞子15 g,木瓜15 g,当归10 g,川芎10 g,熟地黄12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麦冬15 g,花粉15 g),中药饮片由中南大学湘雅医院药剂科提供。中药饮片加水300 mL,浸泡30 min,水煎40 min,第2次煎时加水200 mL,煎煮20 min,取煎汁,混匀,水浴浓缩成每1 mL含2.72 g原药材的药液。
1.3 仪器
TC-512型PCR仪(英国TECHNE公司)；血糖仪；Motic2000图像分析仪；MS302多媒体生物信号记录分析系统。
1.4 试剂
琼脂糖(北京鼎国公司)；溴化乙锭、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；Trizol(MRC公司)；反转录(RT)试剂盒(美国MRI公司)；Pre Mix Taq；引物由上海生工生物技术有限公司合成；其他常规试剂由湘雅医院药剂科提供。
2 实验方法
2.1 分组
65只大鼠适应性喂养1周后,随机取20只为正常组,45只造模,将造模成功后的40只大鼠随机分为模型组20只,加味补肝汤实验组20只。2组血糖值比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.2 造模及给药
参照文献[3]方法。造模前禁食12 h,一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(50 mg/kg,0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制而成,pH4.2～4.5)诱发糖尿病,72 h后用血糖仪测定尾尖血血糖,凡血糖＞16.7 mmol/L为造模成功,造模不成功的大鼠按上述方法重复1次。正常组20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容积0.1 mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。
2.3 血糖测定
尾静脉取血,采用葡萄糖氧化酶法,罗氏公司ACCU-CHEK血糖仪及试纸条测定。
2.4 神经电生理检测
参照文献[4]方法并略加改进,分别于治疗后4、8周末进行神经电生理检测。大鼠一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg),麻醉后俯卧固定,刺激电极置于坐骨切迹(刺激强度2.0 mV,刺激波宽3.0 ms),在踝部(远端)和右足二趾间分别插入记录电极,参考电极置于记录电极和刺激电极之间,并连接计算机MS302多媒体生物信号记录分析系统,记录远近端坐骨神经产生动作电位的潜伏期,测定两记录电极间的距离,神经传导速度为记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差。测定时保持被检测肢体温度在37 ℃左右。
2.5 标本收集
分别于治疗后4、8周一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,俯卧位固定,取左侧梨状肌下缘坐骨神经约1 cm,置于液氮中,-80 ℃保存,用于mRNA检测。
2.6 反转录-聚合酶链反应
引物合成：用Primer Premier 5.0软件设计引物,由上海生工生物技术有限公司合成(见表1)。组织总RNA提取：采用Trizol提取总RNA。按Trizol试剂说明书提取总RNA,溶解于20 μL DEPC处理灭菌双蒸水,经2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并测定A260/A280比值在1.8～2.0之间,说明RNA样品纯度理想；于-70 ℃冻存。
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：cDNA的合成按照反转录试剂盒说明书进行操作：总RNA 2 μL(约0.5 μg),Oligo(dT) l8(50 μg/mL)1 μL,RNasin 1 μL,加EDPC水至11 μL,70 ℃, 5 min；冰上骤冷30 s,加5×Rtbuffer 4 μL,10 mmol/L dNTPMix 2 μL,RNasin 1 μL,加EDPC水至19 μL,37 ℃,5 min；加M-Mulv反转录酶(200 U/μL)1 μL,总体积20 μL,42 ℃,60 min；70 ℃, 10 min。PCR反应体系：cDNA产物2 μL,Pre Mix Taq 12.5 μL, 10 μmol/L目的引物1 μL,β-actin引物1 μL,加DEPC水至25 μL,4 000 r/min短暂离心,于PCR仪扩增。扩增反应：94 ℃预变性5 min,94 ℃变性40 s,56.2 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s,32个循环,最后72 ℃延伸7 min。
4 结果
实验过程中,模型组大鼠死亡4只,加味补肝汤组死亡3只,均在补充实验中补齐到20只。连续给药后,模型组在链脲佐菌素注射72 h后逐渐出现多尿、多饮、多食、毛竖无光泽、蜷卧拱背等症状；加味补肝汤组也有类似表现,但程度较模型组轻。
各组RT-PCR电泳结果显示：模型组治疗4、8周时,PKC-βⅡ mRNA表达(PKC-βⅡmRNA/β-actin mRNA相对吸光度值比)显著增加,随病程延长PKC-βⅡ mRNA含量进一步增加,加味补肝汤干预后PKC-βⅡ mRNA表达水平均明显低于同期模型组(P＜0.05),但明显高于正常组(P＜0.05)。提示加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经PKC-βⅡ mRNA表达有下调作用。
内蒙古中医药投稿 http://www.qikanba.com/
1 实验材料
1.1动物
8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠65只,体重250～280 g,,许可证号SCXK(沪) 2003-003。
1.2 药物
加味补肝汤(枸杞子15 g,木瓜15 g,当归10 g,川芎10 g,熟地黄12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麦冬15 g,花粉15 g),中药饮片由中南大学湘雅医院药剂科提供。中药饮片加水300 mL,浸泡30 min,水煎40 min,第2次煎时加水200 mL,煎煮20 min,取煎汁,混匀,水浴浓缩成每1 mL含2.72 g原药材的药液。
1.3 仪器
TC-512型PCR仪(英国TECHNE公司)；血糖仪；Motic2000图像分析仪；MS302多媒体生物信号记录分析系统。
1.4 试剂
琼脂糖(北京鼎国公司)；溴化乙锭、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；Trizol(MRC公司)；反转录(RT)试剂盒(美国MRI公司)；Pre Mix Taq；引物由上海生工生物技术有限公司合成；其他常规试剂由湘雅医院药剂科提供。
2 实验方法
2.1 分组
65只大鼠适应性喂养1周后,随机取20只为正常组,45只造模,将造模成功后的40只大鼠随机分为模型组20只,加味补肝汤实验组20只。2组血糖值比较差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.2 造模及给药
参照文献[3]方法。造模前禁食12 h,一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(50 mg/kg,0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制而成,pH4.2～4.5)诱发糖尿病,72 h后用血糖仪测定尾尖血血糖,凡血糖＞16.7 mmol/L为造模成功,造模不成功的大鼠按上述方法重复1次。正常组20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容积0.1 mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。
2.3 血糖测定
尾静脉取血,采用葡萄糖氧化酶法,罗氏公司ACCU-CHEK血糖仪及试纸条测定。
2.4 神经电生理检测
参照文献[4]方法并略加改进,分别于治疗后4、8周末进行神经电生理检测。大鼠一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg),麻醉后俯卧固定,刺激电极置于坐骨切迹(刺激强度2.0 mV,刺激波宽3.0 ms),在踝部(远端)和右足二趾间分别插入记录电极,参考电极置于记录电极和刺激电极之间,并连接计算机MS302多媒体生物信号记录分析系统,记录远近端坐骨神经产生动作电位的潜伏期,测定两记录电极间的距离,神经传导速度为记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差。测定时保持被检测肢体温度在37 ℃左右。
2.5 标本收集
分别于治疗后4、8周一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉,俯卧位固定,取左侧梨状肌下缘坐骨神经约1 cm,置于液氮中,-80 ℃保存,用于mRNA检测。
2.6 反转录-聚合酶链反应
引物合成：用Primer Premier 5.0软件设计引物,由上海生工生物技术有限公司合成(见表1)。组织总RNA提取：采用Trizol提取总RNA。按Trizol试剂说明书提取总RNA,溶解于20 μL DEPC处理灭菌双蒸水,经2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,并测定A260/A280比值在1.8～2.0之间,说明RNA样品纯度理想；于-70 ℃冻存。
反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：cDNA的合成按照反转录试剂盒说明书进行操作：总RNA 2 μL(约0.5 μg),Oligo(dT) l8(50 μg/mL)1 μL,RNasin 1 μL,加EDPC水至11 μL,70 ℃, 5 min；冰上骤冷30 s,加5×Rtbuffer 4 μL,10 mmol/L dNTPMix 2 μL,RNasin 1 μL,加EDPC水至19 μL,37 ℃,5 min；加M-Mulv反转录酶(200 U/μL)1 μL,总体积20 μL,42 ℃,60 min；70 ℃, 10 min。PCR反应体系：cDNA产物2 μL,Pre Mix Taq 12.5 μL, 10 μmol/L目的引物1 μL,β-actin引物1 μL,加DEPC水至25 μL,4 000 r/min短暂离心,于PCR仪扩增。扩增反应：94 ℃预变性5 min,94 ℃变性40 s,56.2 ℃退火40 s,72 ℃延伸45 s,32个循环,最后72 ℃延伸7 min。
4 结果
实验过程中,模型组大鼠死亡4只,加味补肝汤组死亡3只,均在补充实验中补齐到20只。连续给药后,模型组在链脲佐菌素注射72 h后逐渐出现多尿、多饮、多食、毛竖无光泽、蜷卧拱背等症状；加味补肝汤组也有类似表现,但程度较模型组轻。
各组RT-PCR电泳结果显示：模型组治疗4、8周时,PKC-βⅡ mRNA表达(PKC-βⅡmRNA/β-actin mRNA相对吸光度值比)显著增加,随病程延长PKC-βⅡ mRNA含量进一步增加,加味补肝汤干预后PKC-βⅡ mRNA表达水平均明显低于同期模型组(P＜0.05),但明显高于正常组(P＜0.05)。提示加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经PKC-βⅡ mRNA表达有下调作用。
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