鬼臼毒素的皮渗透和皮肤贮留研究-眼科新进展投稿
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1 仪器与试药
LC 20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司);C18反相硅胶色谱柱( 4.6 mm×250 mm,5 μm,迪玛科技); TK 12B型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司); FA2004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);0MODEL5000型微量移液器(NICHIRYO,日本);HD 93 1型紫外在线检测仪(上海金达生化仪器有限公司);JEM 100CXⅡ型电子显微镜(日本电子株式会社)。
鬼臼毒素;鬼臼毒素对照品;0.5%鬼臼毒素酊剂;0.5%鬼臼毒素固体脂质纳米粒(自制);单硬脂酸甘油酯;吐温 80(广州化学试剂厂，批号20070701 1);聚乙二醇400;2,6 二叔丁基对甲酚;Sephadex G 50葡聚糖(ICN Biomedicals Inc.，批号94445);甲醇为色谱纯;其余试剂除均为分析纯。大鼠(SD，200～250 g，证号2008A001)、家兔(雄性，2.2 kg，证号2008A020)均购自广东省医学实验动物中心。
2 方法与结果
2.1 固体脂质纳米粒的制备及包封率测定
根据文献[11]改进制备处方和工艺：取单硬脂酸甘油酯 3.0 g、吐温 80 4.0 g、聚乙二醇400 5.0 g、2,6 二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytoluene,BHT) 0.04 g，置70 ℃水浴使其完全熔融形成溶液;然后在200 r·min-1搅拌、70 ℃下加入鬼臼毒素0.5 g，继续搅拌直至形成澄清透明溶液;然后加入10 mL、70 ℃的水，于200 r·min-1搅拌20 min，形成稳定均一的纳米乳;将纳米乳迅速倒入以1 000 r·min-1搅拌的80 mL、2 ℃的水中，搅拌5 min后转速调至200 r·min-1，搅拌3 h，即得。
同法制备不含鬼臼毒素空白固体脂质纳米粒。采用凝胶柱层析法测定上述制品的包封率，常法装Sephadex G 50凝胶柱(1.5 cm×30 cm)，取空白脂质纳米粒1 mL上柱，以水洗脱，饱和柱子;再分别精密吸取载药脂质纳米粒混悬液0.2、0.3、0.5、1 mL上柱，以水洗脱，流速1.0 mL·min-1，在线检测紫外吸收。结果表明，载药脂质纳米粒混悬液上样量为0.2 mL时，凝胶柱可将含药脂质体和游离药物完全分离，柱加样回收率平均为99.32%，RSD为1.64%(n=5)。精密移取鬼臼毒素固体脂质纳米粒混悬液0.2 mL上柱，以水洗脱，分段收集后，测定游离药物的量，按 (m总-m游离)/m总×100%(m总：总药物量，m游离：未包入纳米粒的游离药物量)计算包封率，结果制品包封率平均为95.28%，RSD为2.53%(n=5)。
2.2 分析方法的建立
各取空白固体脂质纳米粒混悬液和载药固体脂质纳米粒混悬液0.1 g，置25 mL量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液进样分析，记录色谱图如图3。由图可见，辅料在该色谱条件下对主药的测定没有干扰。将动物皮肤夹在透皮扩散试验仪供给池与接受池之间(扩散池面积2.92 cm2)，在供给池一侧加入1 mL接受液，接受池含有7 mL接受液与搅拌子(搅拌转速500 r·min-1)，32 ℃恒温搅拌，于24 h取接受液0.5 mL， 0.45μm微孔滤膜过滤后取续滤液，按上述HPLC条件测定，记录色谱图如图4。从图4可见，空白皮肤在该色谱条件下对鬼臼毒素的测定没有干扰。鬼臼毒素低、中、高(5.0、20.0、40.0 μg·mL-1)3 种浓度的样品的日内及日间RSD分别为1.05%、0.71%、0.63%(n=5)及1.44%、0.91%、0.95%(n=5);回收率分别为100.16%、99.86%、100.03%，RSD分别为0.96%、0.65%、0.76%(n=5)。
眼科新进展投稿须知 http://www.qikanba.com/
1 仪器与试药
LC 20A型高效液相色谱仪(日本岛津公司);C18反相硅胶色谱柱( 4.6 mm×250 mm,5 μm,迪玛科技); TK 12B型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司); FA2004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);0MODEL5000型微量移液器(NICHIRYO,日本);HD 93 1型紫外在线检测仪(上海金达生化仪器有限公司);JEM 100CXⅡ型电子显微镜(日本电子株式会社)。
鬼臼毒素;鬼臼毒素对照品;0.5%鬼臼毒素酊剂;0.5%鬼臼毒素固体脂质纳米粒(自制);单硬脂酸甘油酯;吐温 80(广州化学试剂厂，批号20070701 1);聚乙二醇400;2,6 二叔丁基对甲酚;Sephadex G 50葡聚糖(ICN Biomedicals Inc.，批号94445);甲醇为色谱纯;其余试剂除均为分析纯。大鼠(SD，200～250 g，证号2008A001)、家兔(雄性，2.2 kg，证号2008A020)均购自广东省医学实验动物中心。
2 方法与结果
2.1 固体脂质纳米粒的制备及包封率测定
根据文献[11]改进制备处方和工艺：取单硬脂酸甘油酯 3.0 g、吐温 80 4.0 g、聚乙二醇400 5.0 g、2,6 二叔丁基对甲酚(butylated hydroxytoluene,BHT) 0.04 g，置70 ℃水浴使其完全熔融形成溶液;然后在200 r·min-1搅拌、70 ℃下加入鬼臼毒素0.5 g，继续搅拌直至形成澄清透明溶液;然后加入10 mL、70 ℃的水，于200 r·min-1搅拌20 min，形成稳定均一的纳米乳;将纳米乳迅速倒入以1 000 r·min-1搅拌的80 mL、2 ℃的水中，搅拌5 min后转速调至200 r·min-1，搅拌3 h，即得。
同法制备不含鬼臼毒素空白固体脂质纳米粒。采用凝胶柱层析法测定上述制品的包封率，常法装Sephadex G 50凝胶柱(1.5 cm×30 cm)，取空白脂质纳米粒1 mL上柱，以水洗脱，饱和柱子;再分别精密吸取载药脂质纳米粒混悬液0.2、0.3、0.5、1 mL上柱，以水洗脱，流速1.0 mL·min-1，在线检测紫外吸收。结果表明，载药脂质纳米粒混悬液上样量为0.2 mL时，凝胶柱可将含药脂质体和游离药物完全分离，柱加样回收率平均为99.32%，RSD为1.64%(n=5)。精密移取鬼臼毒素固体脂质纳米粒混悬液0.2 mL上柱，以水洗脱，分段收集后，测定游离药物的量，按 (m总-m游离)/m总×100%(m总：总药物量，m游离：未包入纳米粒的游离药物量)计算包封率，结果制品包封率平均为95.28%，RSD为2.53%(n=5)。
2.2 分析方法的建立
各取空白固体脂质纳米粒混悬液和载药固体脂质纳米粒混悬液0.1 g，置25 mL量瓶中，用甲醇定容，0.45 μm滤膜过滤，取续滤液进样分析，记录色谱图如图3。由图可见，辅料在该色谱条件下对主药的测定没有干扰。将动物皮肤夹在透皮扩散试验仪供给池与接受池之间(扩散池面积2.92 cm2)，在供给池一侧加入1 mL接受液，接受池含有7 mL接受液与搅拌子(搅拌转速500 r·min-1)，32 ℃恒温搅拌，于24 h取接受液0.5 mL， 0.45μm微孔滤膜过滤后取续滤液，按上述HPLC条件测定，记录色谱图如图4。从图4可见，空白皮肤在该色谱条件下对鬼臼毒素的测定没有干扰。鬼臼毒素低、中、高(5.0、20.0、40.0 μg·mL-1)3 种浓度的样品的日内及日间RSD分别为1.05%、0.71%、0.63%(n=5)及1.44%、0.91%、0.95%(n=5);回收率分别为100.16%、99.86%、100.03%，RSD分别为0.96%、0.65%、0.76%(n=5)。
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