药性体外皮渗透效果实验分析-心理医生杂志投稿
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1 材料
1.1 仪器
Permcell KH-5P型横式扩散池（日本Vidrex）；LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）；J0100-3电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；SYC15超级恒温水浴（巩义英裕予华仪器厂）；pH计（PBH-3,上海三信仪表厂）；LG16-W离心机（北京医用离心机厂）。
1.2 药物与试剂
乌头碱、延胡索乙素（西安山川生物科技有限公司，纯度大于95%）；人参皂苷Rg1（南京青泽医药科技开发有限公司，纯度大于95%）。磷酸，三乙胺，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾；甲醇、乙腈均为色谱纯。昆明种小鼠，雌雄兼用，鼠龄（50±2）d,体重（20±2）g,大连医科大学动物中心。
2 方法
2.1 分析方法的建立
2.2有效成分稳定性考察
2.2.1 乌头碱稳定性
将一定量的乌头碱用微量甲醇溶解，分别加入纯净水、按2005年版《中华人民共和国药典》（一部）附录方法配制PBS（pH＝5.0）与0.05 mol/L的NaOH溶液，制得乌头碱水溶液（pH＝7.2）、乌头碱酸性缓冲盐溶液（pH＝5,配制方法见“2.5.2”项）与乌头碱碱性溶液（pH＝9.4）。将3种溶液放入恒温水浴锅中[（37±0.5）℃],在配制后10 min及12、24、48 h取样，检测溶液内成分变化，实验结果采用高效液相色谱（HPLC）分析。
2.2.2 延胡索乙素与人参皂苷Rg1稳定性
将延胡索乙素与人参皂苷Rg1分别加入一定浓度的磷酸盐缓冲液PBS（pH＝5.0）和纯净水溶液（pH＝7.2），放入恒温水浴锅中，维持温度为（37±0.5）℃，在配制后1、3、6、9、12、24 h取样，用高效液相色谱分析，考察其在酸性与中性条件下的稳定性。
2.3 油水分配系数的测定
分别测定3种有效成分的油水分配系数（LogP），以正辛醇-水为分配体系。将溶有一定量药物的水相装入试管，加入等体积的正辛醇，在一定强度下振荡，然后于2 000 r/min离心10 min,用HPLC法检测水相中药物浓度（CW）。设水相中原来的药物浓度为C,分配平衡后油相中的药物浓度为C－CW,LogP,用下式计算。
2.4 离体皮肤的制备
取昆明种小鼠，采用脱毛剂（含Na2S 7%）脱毛，48 h后断颈处死，取背部皮肤，确保角质层完好无损，除去皮下组织和脂肪，得到完整离体皮肤。将完整皮肤先用带表卡尺测量厚度，再用透明胶带完全粘附于皮肤表面后揭下，重复15～20次，得到活性表皮，也称去角质层皮肤。所得皮肤采用保鲜膜包裹好后置于密封袋，-20 ℃冰箱保存备用（1周之内使用）。
2.5 体外透皮试验
2.5.1 供给液的配制
3种有效成分在供给液中的浓度与其单成分供给液的浓度相同，配制方法同其单成分供给液的配制。故得到3种含有２种有效成分供给液，分别为人参皂苷Rg1-乌头碱、人参皂苷Rg1-延胡索乙素、延胡索乙素-乌头碱。人参皂苷Rg1-延胡索乙素-乌头碱供给液，其各有效成分在供给液中的浓度与其单成分供给液的浓度相同，配制方法同其单成分供给液的配制。接收液为磷酸盐缓冲溶液（pH＝5.0）。取磷酸二氢钾0.834 g与磷酸氢二钾0.087 g,加水使溶解成100 mL,用磷酸调节pH值到5.0。
2.5.3 试验步骤
将皮肤室温解冻10 h后，平整置于扩散池的接合部，表皮层面向供给池，真皮层面向接收池，然后将两水平相对的扩散池夹紧密封，扩散面积为0.627 cm2。用移液管向接收池内加入5.0 mL PBS,向供给池内加入5.0 mL供给液，维持整个系统在（37±0.5）℃。搅拌子转速为700 r/min,分别在1、3、6、9、12、24 h从接收池内取0.2 mL,并补充同体积PBS。样品用HPLC法测定其浓度，通过下式计算累积透过药量。
Q＝（Cn×V＋∑Cn－1×0.2）A
Q：单位面积累积透过药量（μg/cm2）；V：接收液体积（mL）；A：扩散池口面积（cm2）；Cn：第n次取样的浓度（μg/mL）；式中0.2为每次取样体积。以药物稳定透过皮肤时的累积透过药量Q对时间t进行线性回归所拟合直线的斜率即为经皮稳态渗透速率（ ）V[μg/（cm2·h）]和（ ）W[μg/（cm2·h）]；该直线与时间轴的交点为时滞（h）。根据公式（2.2）计算出试验药物在活性表皮和全皮中的扩散系DV和DW,以及角质层的扩散系数DS。式中：D代表扩散系数；Cs代表药物在皮肤表面的浓度；h和H分别是角质层和活性皮肤的厚度·；v和w分别代表活性表皮和全皮，s代表角质层。
中国现代医生投稿邮箱 http://www.qikanba.com/
1 材料
1.1 仪器
Permcell KH-5P型横式扩散池（日本Vidrex）；LC-2010A高效液相色谱仪（日本岛津）；J0100-3电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；SYC15超级恒温水浴（巩义英裕予华仪器厂）；pH计（PBH-3,上海三信仪表厂）；LG16-W离心机（北京医用离心机厂）。
1.2 药物与试剂
乌头碱、延胡索乙素（西安山川生物科技有限公司，纯度大于95%）；人参皂苷Rg1（南京青泽医药科技开发有限公司，纯度大于95%）。磷酸，三乙胺，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾；甲醇、乙腈均为色谱纯。昆明种小鼠，雌雄兼用，鼠龄（50±2）d,体重（20±2）g,大连医科大学动物中心。
2 方法
2.1 分析方法的建立
2.2有效成分稳定性考察
2.2.1 乌头碱稳定性
将一定量的乌头碱用微量甲醇溶解，分别加入纯净水、按2005年版《中华人民共和国药典》（一部）附录方法配制PBS（pH＝5.0）与0.05 mol/L的NaOH溶液，制得乌头碱水溶液（pH＝7.2）、乌头碱酸性缓冲盐溶液（pH＝5,配制方法见“2.5.2”项）与乌头碱碱性溶液（pH＝9.4）。将3种溶液放入恒温水浴锅中[（37±0.5）℃],在配制后10 min及12、24、48 h取样，检测溶液内成分变化，实验结果采用高效液相色谱（HPLC）分析。
2.2.2 延胡索乙素与人参皂苷Rg1稳定性
将延胡索乙素与人参皂苷Rg1分别加入一定浓度的磷酸盐缓冲液PBS（pH＝5.0）和纯净水溶液（pH＝7.2），放入恒温水浴锅中，维持温度为（37±0.5）℃，在配制后1、3、6、9、12、24 h取样，用高效液相色谱分析，考察其在酸性与中性条件下的稳定性。
2.3 油水分配系数的测定
分别测定3种有效成分的油水分配系数（LogP），以正辛醇-水为分配体系。将溶有一定量药物的水相装入试管，加入等体积的正辛醇，在一定强度下振荡，然后于2 000 r/min离心10 min,用HPLC法检测水相中药物浓度（CW）。设水相中原来的药物浓度为C,分配平衡后油相中的药物浓度为C－CW,LogP,用下式计算。
2.4 离体皮肤的制备
取昆明种小鼠，采用脱毛剂（含Na2S 7%）脱毛，48 h后断颈处死，取背部皮肤，确保角质层完好无损，除去皮下组织和脂肪，得到完整离体皮肤。将完整皮肤先用带表卡尺测量厚度，再用透明胶带完全粘附于皮肤表面后揭下，重复15～20次，得到活性表皮，也称去角质层皮肤。所得皮肤采用保鲜膜包裹好后置于密封袋，-20 ℃冰箱保存备用（1周之内使用）。
2.5 体外透皮试验
2.5.1 供给液的配制
3种有效成分在供给液中的浓度与其单成分供给液的浓度相同，配制方法同其单成分供给液的配制。故得到3种含有２种有效成分供给液，分别为人参皂苷Rg1-乌头碱、人参皂苷Rg1-延胡索乙素、延胡索乙素-乌头碱。人参皂苷Rg1-延胡索乙素-乌头碱供给液，其各有效成分在供给液中的浓度与其单成分供给液的浓度相同，配制方法同其单成分供给液的配制。接收液为磷酸盐缓冲溶液（pH＝5.0）。取磷酸二氢钾0.834 g与磷酸氢二钾0.087 g,加水使溶解成100 mL,用磷酸调节pH值到5.0。
2.5.3 试验步骤
将皮肤室温解冻10 h后，平整置于扩散池的接合部，表皮层面向供给池，真皮层面向接收池，然后将两水平相对的扩散池夹紧密封，扩散面积为0.627 cm2。用移液管向接收池内加入5.0 mL PBS,向供给池内加入5.0 mL供给液，维持整个系统在（37±0.5）℃。搅拌子转速为700 r/min,分别在1、3、6、9、12、24 h从接收池内取0.2 mL,并补充同体积PBS。样品用HPLC法测定其浓度，通过下式计算累积透过药量。
Q＝（Cn×V＋∑Cn－1×0.2）A
Q：单位面积累积透过药量（μg/cm2）；V：接收液体积（mL）；A：扩散池口面积（cm2）；Cn：第n次取样的浓度（μg/mL）；式中0.2为每次取样体积。以药物稳定透过皮肤时的累积透过药量Q对时间t进行线性回归所拟合直线的斜率即为经皮稳态渗透速率（ ）V[μg/（cm2·h）]和（ ）W[μg/（cm2·h）]；该直线与时间轴的交点为时滞（h）。根据公式（2.2）计算出试验药物在活性表皮和全皮中的扩散系DV和DW,以及角质层的扩散系数DS。式中：D代表扩散系数；Cs代表药物在皮肤表面的浓度；h和H分别是角质层和活性皮肤的厚度·；v和w分别代表活性表皮和全皮，s代表角质层。
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