羊肚菌多糖提取、性质测定实验报告-中华医院管理投稿
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1 材料与方法
1.1 试药与仪器
供试菌种羊肚菌GIM5.69[（Morchella esculenta （L.） Pers.）]及黑脉羊肚菌GIM5.29（Morchella elata），广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。纤维素酶和果胶酶由Solarbio公司提供，标准葡聚糖Dextran T70为Pharmacia 公司产品，其余试剂均为国产分析纯。Labofuge 400R台式冷冻离心机（德国Heraeus），恒温培养箱（上海智城），RE-52旋转蒸发仪（上海青浦沪西），BP211D电子天平（德国Sartorius），MLS- 3750灭菌器（日本Sanyo）。
1.2 培养基及培养方法
斜面培养基：采用PDA培养基，含土豆10%、蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH2PO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%,无菌接种后25 ℃培养7～10 d,4 ℃保存。液体种子培养基：含蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中，灭菌后从斜面培养基上接种，25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。发酵培养基：含蔗糖4%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.15%、酵母膏0.5%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中，灭菌后按2%接种量吸取摇床培养的种子培养液接种，25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。
1.3 多糖提取
经过以上培养后得到的羊肚菌菌丝体经过干燥后用于多糖提取，本研究将羊肚菌菌丝体分别以超声、纤维素酶、果胶酶处理后进行多糖提取，并将结果与常规热水浸提加以比较，以获得优化多糖提取方式。
1.3.1 热水浸提
称取5 g干菌丝体，粉碎后加入40倍体积的去离子水，90 ℃，150 min,残渣重复浸提2次。合并上清液，过滤。在37 ℃条件下，上清液用旋转蒸发仪浓缩至适当体积并以ΦMW3500透析袋透析2 d。透析液加3倍95%乙醇沉淀48 h后离心（3 500 r/min,20 min,4 ℃），弃去上清液，收集沉淀，以少量去离子水溶解，真空冷冻干燥得羊肚菌菌丝体粗多糖。
1.3.2 超声提取
称取5 g干菌丝体3份，粉碎后加入40倍体积的去离子水，分别按5、10、15 min 3个水平进行超声波处理，超声频率为40 kHz。然后按热水浸提方式提取羊肚菌粗多糖，方法同前。
1.3.3 酶法提取
经正交试验[4]确定，对于果胶酶和纤维素酶而言，酶量的极差最大，是影响多糖提取率的关键因子，其次是酶处理的时间，温度的影响最小，酶处理的最佳条件是酶加量15%、50 ℃、3 h。故试验中称取5 g干菌丝体粉碎，加入20倍体积水，加入0.15 g酶，酶解3 h,酶解后加入20倍体积的水，热水浸提提取羊肚菌粗多糖，方法同前。
1.4 多糖得率比较及多糖含量测定
称取不同提取方法所获得的粗多糖，比较其重量。同时鉴于粗多糖中可能含有一定杂质，对试验结果有影响，进一步对粗多糖中多糖含量进行检测并加以比较。配制标准葡聚糖（Dextran）T70（40 μg/mL），分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,各以去离子水补至2.0 mL。再加入6%苯酚1.0 mL以及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀，室温放置10 min后，测吸光值（A490），绘制标准曲线。同时将试验所获粗多糖以去离子水定容至100 mL,取样品1 mL,苯酚-硫酸法检测A490,同时对照标准曲线计算多糖含量。
2 结果
2.1 多糖性质测定
在以往对多糖提取方法的优化研究中，通常以最终粗多糖得率来衡量提取技术优劣，如武氏等[6]对羊肚菌多糖提取方法优化后所得粗多糖得率为2.58%。该衡量标准较直观快捷，但因粗多糖中仍存在一定杂质，故结果可能有一定误差。本研究在统计粗多糖重量基础上进一步采用苯酚-硫酸法精确测量粗多糖中总糖含量，从糖得率上看数值较低，但结果更为精确。羊肚菌多糖溶于水，不溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。与I2-KI反应不显示蓝色，说明其为非淀粉类多糖。与斐林试剂反应及FeCl3反应为阴性，说明不含单糖和多酚类物质；Molish反应为阳性，说明是典型的糖类物质；CTAB反应和硫酸-咔唑反应阳性，说明含有糖醛酸。对羊肚菌多糖在190～390 nm扫描发现，其对核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）无明显吸收峰[7],可知该多糖样品中不含游离核酸及蛋白等杂质。试验结果表明，超声和酶法处理均可显着提高多糖得率，且两类菌种多糖得率也有明显差异。提取方法以超声10 min,超声频率为40 kHz,在90 ℃下，恒温加热150 min,浸提2次，多糖的得率最高。两种菌种之中，以GIM5.69型菌种多糖得率较高。
中华检验医学投稿 http://www.qikanba.com/
1 材料与方法
1.1 试药与仪器
供试菌种羊肚菌GIM5.69[（Morchella esculenta （L.） Pers.）]及黑脉羊肚菌GIM5.29（Morchella elata），广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心提供。纤维素酶和果胶酶由Solarbio公司提供，标准葡聚糖Dextran T70为Pharmacia 公司产品，其余试剂均为国产分析纯。Labofuge 400R台式冷冻离心机（德国Heraeus），恒温培养箱（上海智城），RE-52旋转蒸发仪（上海青浦沪西），BP211D电子天平（德国Sartorius），MLS- 3750灭菌器（日本Sanyo）。
1.2 培养基及培养方法
斜面培养基：采用PDA培养基，含土豆10%、蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、KH2PO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%,无菌接种后25 ℃培养7～10 d,4 ℃保存。液体种子培养基：含蔗糖3%、蛋白胨0.1%、酵母膏0.5%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.05%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中，灭菌后从斜面培养基上接种，25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。发酵培养基：含蔗糖4%、NH4NO3 0.3%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.15%、酵母膏0.5%；每瓶200 mL分装于500 mL三角瓶中，灭菌后按2%接种量吸取摇床培养的种子培养液接种，25 ℃摇床培养10～14 d,转速180 r/min。
1.3 多糖提取
经过以上培养后得到的羊肚菌菌丝体经过干燥后用于多糖提取，本研究将羊肚菌菌丝体分别以超声、纤维素酶、果胶酶处理后进行多糖提取，并将结果与常规热水浸提加以比较，以获得优化多糖提取方式。
1.3.1 热水浸提
称取5 g干菌丝体，粉碎后加入40倍体积的去离子水，90 ℃，150 min,残渣重复浸提2次。合并上清液，过滤。在37 ℃条件下，上清液用旋转蒸发仪浓缩至适当体积并以ΦMW3500透析袋透析2 d。透析液加3倍95%乙醇沉淀48 h后离心（3 500 r/min,20 min,4 ℃），弃去上清液，收集沉淀，以少量去离子水溶解，真空冷冻干燥得羊肚菌菌丝体粗多糖。
1.3.2 超声提取
称取5 g干菌丝体3份，粉碎后加入40倍体积的去离子水，分别按5、10、15 min 3个水平进行超声波处理，超声频率为40 kHz。然后按热水浸提方式提取羊肚菌粗多糖，方法同前。
1.3.3 酶法提取
经正交试验[4]确定，对于果胶酶和纤维素酶而言，酶量的极差最大，是影响多糖提取率的关键因子，其次是酶处理的时间，温度的影响最小，酶处理的最佳条件是酶加量15%、50 ℃、3 h。故试验中称取5 g干菌丝体粉碎，加入20倍体积水，加入0.15 g酶，酶解3 h,酶解后加入20倍体积的水，热水浸提提取羊肚菌粗多糖，方法同前。
1.4 多糖得率比较及多糖含量测定
称取不同提取方法所获得的粗多糖，比较其重量。同时鉴于粗多糖中可能含有一定杂质，对试验结果有影响，进一步对粗多糖中多糖含量进行检测并加以比较。配制标准葡聚糖（Dextran）T70（40 μg/mL），分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL,各以去离子水补至2.0 mL。再加入6%苯酚1.0 mL以及浓硫酸5.0 mL,静置10 min,摇匀，室温放置10 min后，测吸光值（A490），绘制标准曲线。同时将试验所获粗多糖以去离子水定容至100 mL,取样品1 mL,苯酚-硫酸法检测A490,同时对照标准曲线计算多糖含量。
2 结果
2.1 多糖性质测定
在以往对多糖提取方法的优化研究中，通常以最终粗多糖得率来衡量提取技术优劣，如武氏等[6]对羊肚菌多糖提取方法优化后所得粗多糖得率为2.58%。该衡量标准较直观快捷，但因粗多糖中仍存在一定杂质，故结果可能有一定误差。本研究在统计粗多糖重量基础上进一步采用苯酚-硫酸法精确测量粗多糖中总糖含量，从糖得率上看数值较低，但结果更为精确。羊肚菌多糖溶于水，不溶于丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。与I2-KI反应不显示蓝色，说明其为非淀粉类多糖。与斐林试剂反应及FeCl3反应为阴性，说明不含单糖和多酚类物质；Molish反应为阳性，说明是典型的糖类物质；CTAB反应和硫酸-咔唑反应阳性，说明含有糖醛酸。对羊肚菌多糖在190～390 nm扫描发现，其对核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）无明显吸收峰[7],可知该多糖样品中不含游离核酸及蛋白等杂质。试验结果表明，超声和酶法处理均可显着提高多糖得率，且两类菌种多糖得率也有明显差异。提取方法以超声10 min,超声频率为40 kHz,在90 ℃下，恒温加热150 min,浸提2次，多糖的得率最高。两种菌种之中，以GIM5.69型菌种多糖得率较高。
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