当归中药材道地性研究-医学综述网上投稿
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道地药材的形成是特定的基因型，在特定的生境下受到复杂的调控，导致次生代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的结果，其形态及次生代谢产物的多样性是由基因的遗传变异引起的[2]。不少学者在研究道地药材分子机理时，都期望能找到决定道地药材的表型的关键酶基因，发现道地药材特定的基因型，但尚未取得突破性进展。ITS序列作为种以下一级分类群亲缘关系研究的重要基因序列，在中药材道地性研究中也得到了广泛应用。
1 材料与方法
1.1 药材来源
本试验所用药材均为2005年采自甘肃省岷县及漳县地区农民种植的当归种子，自然干燥后备用，经甘肃中医学院张西玲教授鉴定。见表1。表1 甘肃不同产地当归药材（略）
1.2 ITS序列扩增
以已经发表于genebank中的当归ITS序列为标准，设计一对引物，引物序列为：ITS正，5'-TTGTCGAATCCTGCAATAGC； ITS反，5'-TCGAAGCGCACAGAGTATG。PCR反应采用上海生物工程技术服务有限公司提供的即用型PCR扩增试剂盒，反应体系为50 μL,其中2×Master 25 μL,上下游引物各5 μL,模板1 L,ddH2O,14 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性1 min,94 ℃变性1 min；53 ℃复性1 min；72 ℃延伸1 min；共35循环，72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。
1.3 基因组DNA提取
称取种子100 mg用医用纱布包好，置于液氮中10 min,取出后用研钵研细，用筛网过滤后称取细粉50 mg,然后按照上海生物工程技术服务有限公司生产的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取，提取的基因组DNA于-20 ℃保存，备用。
1.4 序列测定和分析
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程技术服务有限公司测序，每个样品均采用双向测序。测序结果以已经发表于genebank中的当归ITS序列确定ITS序列的边界，并进行两端碱基手工修订。各序列特征采用DNAStar软件进行统计分析；DNA序列的用DNAMAN软件排序，排序后的序列采用MEGA4[1]（molecular evolutionary genetics analysis 4）分子进化遗传分析软件，根据Kimura-2参数遗传距离（kimura-2 parameter genetic distance）法计算各样品间的遗传距离值。
2 结果与分析
本实验测得的9样品ITS（包括5.8s）序列中7样品为600 bp, 2样品为601 bp。所有样品5.8srDNA高度一致，无碱基差异。ITS一区有3个变异位点，ITS二区有3个变异位点。各样品ITS序列（包括5.8s）G＋C含量范围在54.1%～54.6%之间。
医学信息杂志投稿 http://www.qikanba.com/
道地药材的形成是特定的基因型，在特定的生境下受到复杂的调控，导致次生代谢过程的关键酶基因的表达产生了时空差异的结果，其形态及次生代谢产物的多样性是由基因的遗传变异引起的[2]。不少学者在研究道地药材分子机理时，都期望能找到决定道地药材的表型的关键酶基因，发现道地药材特定的基因型，但尚未取得突破性进展。ITS序列作为种以下一级分类群亲缘关系研究的重要基因序列，在中药材道地性研究中也得到了广泛应用。
1 材料与方法
1.1 药材来源
本试验所用药材均为2005年采自甘肃省岷县及漳县地区农民种植的当归种子，自然干燥后备用，经甘肃中医学院张西玲教授鉴定。见表1。表1 甘肃不同产地当归药材（略）
1.2 ITS序列扩增
以已经发表于genebank中的当归ITS序列为标准，设计一对引物，引物序列为：ITS正，5'-TTGTCGAATCCTGCAATAGC； ITS反，5'-TCGAAGCGCACAGAGTATG。PCR反应采用上海生物工程技术服务有限公司提供的即用型PCR扩增试剂盒，反应体系为50 μL,其中2×Master 25 μL,上下游引物各5 μL,模板1 L,ddH2O,14 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性1 min,94 ℃变性1 min；53 ℃复性1 min；72 ℃延伸1 min；共35循环，72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。
1.3 基因组DNA提取
称取种子100 mg用医用纱布包好，置于液氮中10 min,取出后用研钵研细，用筛网过滤后称取细粉50 mg,然后按照上海生物工程技术服务有限公司生产的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取，提取的基因组DNA于-20 ℃保存，备用。
1.4 序列测定和分析
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程技术服务有限公司测序，每个样品均采用双向测序。测序结果以已经发表于genebank中的当归ITS序列确定ITS序列的边界，并进行两端碱基手工修订。各序列特征采用DNAStar软件进行统计分析；DNA序列的用DNAMAN软件排序，排序后的序列采用MEGA4[1]（molecular evolutionary genetics analysis 4）分子进化遗传分析软件，根据Kimura-2参数遗传距离（kimura-2 parameter genetic distance）法计算各样品间的遗传距离值。
2 结果与分析
本实验测得的9样品ITS（包括5.8s）序列中7样品为600 bp, 2样品为601 bp。所有样品5.8srDNA高度一致，无碱基差异。ITS一区有3个变异位点，ITS二区有3个变异位点。各样品ITS序列（包括5.8s）G＋C含量范围在54.1%～54.6%之间。
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