脑缺血卒中的药理作用研究-基层临床医学论文
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1 材料
1.1 药物受试药物：通脉醒脑滴丸，成都润华堂药业有限公司产品，批号：070530。规格：10 mg/粒。用法用量：口服，88粒/d，分4次服用。主治缺血性中风引起的半身不遂、口眼歪斜、言语不利、偏身麻木等。阳性对照药物：尼莫地平片，山西亚宝药业集团股份有限公司产品，批号：070109。规格：20 mg/片。用法用量：用于治疗缺血性脑血管病，口服，30～120mg/d。
1.2 试剂Rabbit Anti-Caspase-3，北京博奥生物技术有限公司产品；Cytochrome C（A-8）SC-13156，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；Bax（P-19）SC-526，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；bcl-2 GM88702，基因有限公司产品；ChemMate Envision HRP鼠/兔 GK500705，基因有限公司产品；其它实验室常备试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器Leica rm 2135石蜡切片机，德国；Olympus-BX40型光学显微镜，日本Olympus公司产品；MIAS2000型计算机图像工作系统；LD2-5医用离心机，北京医用离心机厂产品；WH-2型微量旋涡混合仪；DHW-600型不锈钢电热恒温水箱，北京国华医疗器械厂产品；202-2型干燥箱，上海市实验仪器总厂产品。其它实验室常备器皿、耗材均为国产优质品。
1.4 动物 SD大鼠，SPF级，质量（300±20）g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK（川）2004-15。
2 方法
2.1 分组及给药选取健康SD大鼠18只，雌雄各半，随机将大鼠分为模型组、给药组、假手术组3组，每组6只。其中给药组给予通脉醒脑滴丸73.85 mg/kg;模型组和假手术组给予等体积蒸馏水。灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。于第7天给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。模型组和给药组参照下述方法，复制线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型。
再灌注24 h后，各组大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开胸壁，暴露心脏，将灌流装置的针头刺入左心室，止血钳固定，剪开右心耳，生理盐水250 ml快速灌流冲洗至肺叶和肝脏变白，换用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 ml灌注固定，30 min后断头取脑，置于4%多聚甲醛中低温避光固定24 h。心脏灌流前1h给药1次。
常规制备石蜡切片，HE染色项下，采用DAKO EnVision显色系统，光镜100×视野下寻找海马结构，400×视野下，运用电子科技大学金盘科技有限公司MIAS2000型计算机图像工作系统，对染色结果进行检测，每张片选取不重叠的10个视野，每个视野选20个细胞，统计阳性表达的细胞数和阳性面积百分比。
2.2 实验证明，通脉醒脑滴丸可通过减少脑组织Bax的阳性表达，负调Caspase-3介导的细胞凋亡的线粒体通路，保护缺血损伤的脑组织。
由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。细胞内外的凋亡因素通过各种受体作用于细胞后，产生一系列复杂的生化反应，形成与凋亡相关的第二信使，继而通过胞内的信号转导途径激活后续凋亡程序。调控凋亡的基因接受由信号转导途径传来的死亡信号后，启动并合成执行凋亡所需的各种酶类和相关物质。继而由核酸内切酶和Caspase执行死亡，前者破坏生命活动必须的所有指令，后者导致细胞结构的全面解体。
Cyt-C是生物氧化的一个非常重要的电子传递体。正常情况下细胞色素C稳定性地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。在受到凋亡信号的刺激后，细胞色素c通过线粒体膜的渗透性转移孔道释放出来，与凋亡促进因子-l（Apaf-1）和Caspase-9结合形成复合体，在ATP参与下，使Caspase蛋白酶家族发生酶解级联激活，主要通过Caspase-3的激活造成基因组DNA裂解，同时使DNA修复相关酶失活，造成DNA修复能力降低，以凋亡执行过程[8]。细胞色素C的胞外释放是脑缺血再灌注后线粒体凋亡通路中的关键的环节，应用激光共聚焦，放射免疫测定等实验方法，都证实了线粒体依赖性的凋亡通路中细胞色素C胞外释放这一环节[9]。
结果显示通脉醒脑滴丸可明显减少Caspase-3、Cyt-C阳性细胞个数，且着色较浅。表明通脉醒脑滴丸可能通过减少Cyt-C释放和下调Caspase-3蛋白的表达而减少凋亡的产生，在线粒体途径所介导的细胞凋亡过程中发挥了脑保护作用。同时，与模型组比较，通脉醒脑滴丸组大鼠海马区Bax表达明显减少。表明通脉醒脑滴丸能通过下调凋亡促进因子Bax的表达，抑制Cyt-C释放，对抗缺血再灌注后脑神经细胞的凋亡，发挥脑缺血防治作用。
有研究发现，在生长发育过程中，神经系统的bcl-2蛋白呈高表达，以后随年龄的增加bcl-2免疫反应迅速下降，成年后bcl-2蛋白的免疫反应通常不能检出，故假手术组未见bcl-2阳性表达。模型组仅出现少量bcl-2阳性表达，通脉醒脑滴丸组亦未见bcl-2阳性表达，提示药物对抗细胞凋亡的作用机制，可能主要与减少Bax基因的表达，抑制Cyt-C从线粒体的释放相关。
综上所述，通脉醒脑滴丸可通过减少缺血脑组织海马Bax、Cyt-C和Caspase-3的阳性表达，抑制Caspase-3介导的细胞凋亡，发挥对抗脑缺血的作用，为中药复方制剂防治脑缺血卒中的机理提供了新的佐证。
腹外疝临床医学论文 http://www.qikanba.com/
1 材料
1.1 药物受试药物：通脉醒脑滴丸，成都润华堂药业有限公司产品，批号：070530。规格：10 mg/粒。用法用量：口服，88粒/d，分4次服用。主治缺血性中风引起的半身不遂、口眼歪斜、言语不利、偏身麻木等。阳性对照药物：尼莫地平片，山西亚宝药业集团股份有限公司产品，批号：070109。规格：20 mg/片。用法用量：用于治疗缺血性脑血管病，口服，30～120mg/d。
1.2 试剂Rabbit Anti-Caspase-3，北京博奥生物技术有限公司产品；Cytochrome C（A-8）SC-13156，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；Bax（P-19）SC-526，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；bcl-2 GM88702，基因有限公司产品；ChemMate Envision HRP鼠/兔 GK500705，基因有限公司产品；其它实验室常备试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器Leica rm 2135石蜡切片机，德国；Olympus-BX40型光学显微镜，日本Olympus公司产品；MIAS2000型计算机图像工作系统；LD2-5医用离心机，北京医用离心机厂产品；WH-2型微量旋涡混合仪；DHW-600型不锈钢电热恒温水箱，北京国华医疗器械厂产品；202-2型干燥箱，上海市实验仪器总厂产品。其它实验室常备器皿、耗材均为国产优质品。
1.4 动物 SD大鼠，SPF级，质量（300±20）g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK（川）2004-15。
2 方法
2.1 分组及给药选取健康SD大鼠18只，雌雄各半，随机将大鼠分为模型组、给药组、假手术组3组，每组6只。其中给药组给予通脉醒脑滴丸73.85 mg/kg;模型组和假手术组给予等体积蒸馏水。灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。于第7天给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。模型组和给药组参照下述方法，复制线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型。
再灌注24 h后，各组大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开胸壁，暴露心脏，将灌流装置的针头刺入左心室，止血钳固定，剪开右心耳，生理盐水250 ml快速灌流冲洗至肺叶和肝脏变白，换用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 ml灌注固定，30 min后断头取脑，置于4%多聚甲醛中低温避光固定24 h。心脏灌流前1h给药1次。
常规制备石蜡切片，HE染色项下，采用DAKO EnVision显色系统，光镜100×视野下寻找海马结构，400×视野下，运用电子科技大学金盘科技有限公司MIAS2000型计算机图像工作系统，对染色结果进行检测，每张片选取不重叠的10个视野，每个视野选20个细胞，统计阳性表达的细胞数和阳性面积百分比。
2.2 实验证明，通脉醒脑滴丸可通过减少脑组织Bax的阳性表达，负调Caspase-3介导的细胞凋亡的线粒体通路，保护缺血损伤的脑组织。
由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡（apoptosis），又称程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。细胞内外的凋亡因素通过各种受体作用于细胞后，产生一系列复杂的生化反应，形成与凋亡相关的第二信使，继而通过胞内的信号转导途径激活后续凋亡程序。调控凋亡的基因接受由信号转导途径传来的死亡信号后，启动并合成执行凋亡所需的各种酶类和相关物质。继而由核酸内切酶和Caspase执行死亡，前者破坏生命活动必须的所有指令，后者导致细胞结构的全面解体。
Cyt-C是生物氧化的一个非常重要的电子传递体。正常情况下细胞色素C稳定性地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。在受到凋亡信号的刺激后，细胞色素c通过线粒体膜的渗透性转移孔道释放出来，与凋亡促进因子-l（Apaf-1）和Caspase-9结合形成复合体，在ATP参与下，使Caspase蛋白酶家族发生酶解级联激活，主要通过Caspase-3的激活造成基因组DNA裂解，同时使DNA修复相关酶失活，造成DNA修复能力降低，以凋亡执行过程[8]。细胞色素C的胞外释放是脑缺血再灌注后线粒体凋亡通路中的关键的环节，应用激光共聚焦，放射免疫测定等实验方法，都证实了线粒体依赖性的凋亡通路中细胞色素C胞外释放这一环节[9]。
结果显示通脉醒脑滴丸可明显减少Caspase-3、Cyt-C阳性细胞个数，且着色较浅。表明通脉醒脑滴丸可能通过减少Cyt-C释放和下调Caspase-3蛋白的表达而减少凋亡的产生，在线粒体途径所介导的细胞凋亡过程中发挥了脑保护作用。同时，与模型组比较，通脉醒脑滴丸组大鼠海马区Bax表达明显减少。表明通脉醒脑滴丸能通过下调凋亡促进因子Bax的表达，抑制Cyt-C释放，对抗缺血再灌注后脑神经细胞的凋亡，发挥脑缺血防治作用。
有研究发现，在生长发育过程中，神经系统的bcl-2蛋白呈高表达，以后随年龄的增加bcl-2免疫反应迅速下降，成年后bcl-2蛋白的免疫反应通常不能检出，故假手术组未见bcl-2阳性表达。模型组仅出现少量bcl-2阳性表达，通脉醒脑滴丸组亦未见bcl-2阳性表达，提示药物对抗细胞凋亡的作用机制，可能主要与减少Bax基因的表达，抑制Cyt-C从线粒体的释放相关。
综上所述，通脉醒脑滴丸可通过减少缺血脑组织海马Bax、Cyt-C和Caspase-3的阳性表达，抑制Caspase-3介导的细胞凋亡，发挥对抗脑缺血的作用，为中药复方制剂防治脑缺血卒中的机理提供了新的佐证。
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