黄酮类化合物药用价值临床研究-消化内科论文
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柚皮苷全称为柚皮素 7 O 新橙皮糖苷，属二氢黄酮类化合物，是橘红、骨碎补、枳实、枳壳等中药的主要有效成分[6]，具有显着的抗氧化作用、抗炎、抗内毒素作用。本实验中，通过ELISA直接RANTES的含量，证明了柚皮苷能抑制被TNF α与IFN γ诱导的HaCaT细胞的RANTES的产生。同时分析了编码RANTES基因的转录，应用荧光定量PCR技术，该技术为实时（Real Time）荧光定量PCR，检测对象为反应进程中模板DNA拷贝数的即时变化而非终产物含量。因而能够通过对Ct值（扩增曲线进入指数期时的反应循环数）的准确判读，按指数扩增的规律计算出初始模板拷贝数。样本的Ct值与该样本起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。同时MTT法测定柚皮苷在1mmol·L-1的情况下几乎不影响HACAT细胞的活力，说明抑制RANTES的诱导产生不是由于柚皮苷对细胞的潜在毒性而致。推测柚皮苷抑制RANTES基因的转录以及表达可能通过一定的信号通路，有待进一步研究。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 柚皮苷（纯度99%, Sigma 公司）、阿维A ；TNF α和INF γ （美国PEPROTECH Asia）；DMEM 培养基（Gibco）；M TT（3 （4 ,5） 双甲基 2 噻唑 （2 ,5） 二苯基溴化四氮唑蓝，Sigma 公司）；Taq DNA聚合酶（北京博大泰克BioDev生物基因技术有限责任公司）；引物（上海生物工程有限公司）；人RANTES定量ELISA试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）；人表皮角质形成细胞HaCaT细胞株（本室保存）。
1.2MTT比色分析按照文献方法[4]，在96 孔培养板中加HACAT 细胞悬液（1.5×104 个细胞/ 孔）培养过夜，依次加入含药的完全培养基，实验组分别加入不同浓度的柚皮苷，阳性对照药采用阿维A，药物浓度见表1，阴性照组用培养液替代药物，空白组仅加入不含细胞的培养液，每个浓度做3 个复孔。OD 值测定波长为570 nm。结果按下式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率% = （1 实验组OD 值/对照组OD 值）×100 %;以药物的不同浓度对角质细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的半数杀伤浓度IC50。
1.3 细胞培养上清液RANTES含量测定 将HaCaT细胞接种于24孔板中（5×104/孔），加入含刺激因子（TNF α和/或INF γ）的无血清 DMEM培养基孵育24 h，同时进行实验组研究：不同浓度的柚皮苷以及阳性对照阿维A；每组各设3个复孔（见表2）。按照试剂盒内说明测定上清液中RANTES的含量。
2 结果
结果见Tab.2，HaCaT细胞在用TNF α联合INF γ刺激48小时后，上清液所含RANTES的浓度明显增加，HaCaT细胞的形态产生了明显的变化，阿维A在 5×10-3 mmol·L-1，柚皮苷0.5、0.25 mmol·L-1预处理30min后可明显抑制RANTES的产生。注：对照组相比 **P＜0.01 ***P＜0.0012.3RANTES mRNA的表达实时定量RT PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，RANTES、GAPDH的mRNA基因转录扩增片段均在相应的分子量位置（Fig. 1）。
根据实时荧光定量基因扩增的动力曲线，各组目的基因RANTES以及内参GAPDH的mRNA相对量的比值见Fig.2。正常培养HaCaT细胞及经TNF α+INF γ、TNF α+INF γ+阿维A、TNF α+INF γ+柚皮苷处理细胞均有RANTES、GAPDH表达；RANTES在细胞因子处理的细胞中显着表达，细胞因子未处理细胞微弱表达；而经阿维A、柚皮苷处理的细胞明显降低。黄酮类化合物具有显着的抗氧化作用、抗炎、抗内毒素作用，其抗氧化作用与细胞内某些还原酶如谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强有关[3]。而柚皮苷增强体内还原酶活性不足以解释其显着的抗炎、抗内毒素作用。为此，研究观察柚皮苷抑制人皮肤角质细胞RANTES产生的作用。
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柚皮苷全称为柚皮素 7 O 新橙皮糖苷，属二氢黄酮类化合物，是橘红、骨碎补、枳实、枳壳等中药的主要有效成分[6]，具有显着的抗氧化作用、抗炎、抗内毒素作用。本实验中，通过ELISA直接RANTES的含量，证明了柚皮苷能抑制被TNF α与IFN γ诱导的HaCaT细胞的RANTES的产生。同时分析了编码RANTES基因的转录，应用荧光定量PCR技术，该技术为实时（Real Time）荧光定量PCR，检测对象为反应进程中模板DNA拷贝数的即时变化而非终产物含量。因而能够通过对Ct值（扩增曲线进入指数期时的反应循环数）的准确判读，按指数扩增的规律计算出初始模板拷贝数。样本的Ct值与该样本起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。同时MTT法测定柚皮苷在1mmol·L-1的情况下几乎不影响HACAT细胞的活力，说明抑制RANTES的诱导产生不是由于柚皮苷对细胞的潜在毒性而致。推测柚皮苷抑制RANTES基因的转录以及表达可能通过一定的信号通路，有待进一步研究。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 柚皮苷（纯度99%, Sigma 公司）、阿维A ；TNF α和INF γ （美国PEPROTECH Asia）；DMEM 培养基（Gibco）；M TT（3 （4 ,5） 双甲基 2 噻唑 （2 ,5） 二苯基溴化四氮唑蓝，Sigma 公司）；Taq DNA聚合酶（北京博大泰克BioDev生物基因技术有限责任公司）；引物（上海生物工程有限公司）；人RANTES定量ELISA试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）；人表皮角质形成细胞HaCaT细胞株（本室保存）。
1.2MTT比色分析按照文献方法[4]，在96 孔培养板中加HACAT 细胞悬液（1.5×104 个细胞/ 孔）培养过夜，依次加入含药的完全培养基，实验组分别加入不同浓度的柚皮苷，阳性对照药采用阿维A，药物浓度见表1，阴性照组用培养液替代药物，空白组仅加入不含细胞的培养液，每个浓度做3 个复孔。OD 值测定波长为570 nm。结果按下式计算药物对细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率% = （1 实验组OD 值/对照组OD 值）×100 %;以药物的不同浓度对角质细胞生长抑制率作图可得到剂量反应曲线，从中求出药物的半数杀伤浓度IC50。
1.3 细胞培养上清液RANTES含量测定 将HaCaT细胞接种于24孔板中（5×104/孔），加入含刺激因子（TNF α和/或INF γ）的无血清 DMEM培养基孵育24 h，同时进行实验组研究：不同浓度的柚皮苷以及阳性对照阿维A；每组各设3个复孔（见表2）。按照试剂盒内说明测定上清液中RANTES的含量。
2 结果
结果见Tab.2，HaCaT细胞在用TNF α联合INF γ刺激48小时后，上清液所含RANTES的浓度明显增加，HaCaT细胞的形态产生了明显的变化，阿维A在 5×10-3 mmol·L-1，柚皮苷0.5、0.25 mmol·L-1预处理30min后可明显抑制RANTES的产生。注：对照组相比 **P＜0.01 ***P＜0.0012.3RANTES mRNA的表达实时定量RT PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，RANTES、GAPDH的mRNA基因转录扩增片段均在相应的分子量位置（Fig. 1）。
根据实时荧光定量基因扩增的动力曲线，各组目的基因RANTES以及内参GAPDH的mRNA相对量的比值见Fig.2。正常培养HaCaT细胞及经TNF α+INF γ、TNF α+INF γ+阿维A、TNF α+INF γ+柚皮苷处理细胞均有RANTES、GAPDH表达；RANTES在细胞因子处理的细胞中显着表达，细胞因子未处理细胞微弱表达；而经阿维A、柚皮苷处理的细胞明显降低。黄酮类化合物具有显着的抗氧化作用、抗炎、抗内毒素作用，其抗氧化作用与细胞内某些还原酶如谷胱甘肽还原酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性增强有关[3]。而柚皮苷增强体内还原酶活性不足以解释其显着的抗炎、抗内毒素作用。为此，研究观察柚皮苷抑制人皮肤角质细胞RANTES产生的作用。
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