黑麦酮酸D衍生物抗乳腺癌的药用价值研究-医学毕业论文格式范文
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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，自20世纪50年代始，随着光谱学、高通量筛选以及结构分析技术等的发展，已从海洋生物中分离筛选到如ecteinascidin-743、aplidine、bryostatin 1、黑麦酮酸D素等多种具有结构多样且效果较好的抗肿瘤活性物质 [4-8]。D69是从海洋源性的一株链霉菌菌株的次生代谢产物中分离得到的一种化合物，含有环状的五肽内酯环和发色基团，属于新型的黑麦酮酸D衍生物。通过对其体内外具有潜在的抗肿瘤活性的研究，从细胞和分子水平上初步探讨D69对人乳腺癌细胞生长的抑制作用和诱导凋亡作用，为进一步开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和ZR-75-30、人永生化乳腺上皮细胞系HMEC（human mammary epithelial cell）均为本实验室保存，并已在本实验室已发表的其他研究项目中使用[9]。
1.1.2化合物D69由中山大学化学与化学工程学院林永成教授提供。其结构运用核磁共振（H-NMR、13C-NMR、 HSQC、HMBC）、高分辨质谱 （ESI-MS ）等进行初步鉴定[10]。各种化合物由二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）制备保存母液。
1.1.3实验动物清洁级雌性BALB/c裸鼠，体质量18～20 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2008-0020，粤监证字：2008A004。在中山大学实验动物中心动物实验部以SPF条件饲养，实验动物许可证号：SYXK（粤）2007-0081。
1.2方法
1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和ZR-75-30培养于含5%（φ）胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L HEPES、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5%（φ）CO2孵箱中孵育培养；传代时先用1× PBS清洗细胞，再用含0.02%EDTA的0.05 %胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。人乳腺上皮细胞HMEC培养于无血清KSFM培养基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培养；传代时用上述胰酶消化，以胰酶抑制剂终止消化。以上细胞培养相关试剂均为Invitrogen/Gibco公司产品，胎牛血清购自Hyclone公司。
1.2.2四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖将MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞消化后重悬并计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培养。24 h后去除培养基，更换为含浓度依次为0、0 001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 μmol/L D69的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48 h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入5 mg/mL MTT （Genview公司，用1×磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5 mg/mL，过滤除菌，分装后-20 ℃避光保存）溶液20 μL，37 ℃作用4 h，离心后弃上清液，加入DMSO 150 μL,振荡器振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为570 nm下的吸光度A值。细胞生长抑制率（%）=（对照组平均A值-实验组平均A值）/对照组平均A值×100 %。对照组即D69浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度（IC50）计算软件Bliss's software计算IC50，应用SPSS软件进行数据统计分析。
1.2.3D69抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-435生长的体内实验每只BALB/c裸鼠右侧乳腺接种数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞5×106（100 μL）。接种肿瘤后第6天，将14只裸鼠随机等分为2组。待瘤直径在30~50 mm后，以30 μg/kg剂量的D69，每2天腹腔注射给药1次，持续30 d，观察并记录D69的体内抑瘤作用。肿瘤体积计算公式：体积（mm3）=长径×短径2×π/6。根据各组皮下移植瘤体积，计算各个时间点肿瘤体积的均数值并绘制肿瘤生长曲线。D69注射29 d后，处死，迅速取下肿瘤标本，称重。抑制率=（1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。所有动物实验操作均遵守《实验动物管理条例》（中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号，1988）。
2结果
2.1D69对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、ZR-75-30生长和形态的影响
在倒置光学显微镜下观察D69处理后细胞生长情况及形态学变化，发现D69对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、ZR-75-30的生长具有显着的抑制作用（见图1、2）。随着D69浓度的增加，细胞生长抑制及细胞死亡现象越来越明显，出现大面积的脱落，细胞及细胞碎片漂浮液面。这种细胞形态的改变与细胞凋亡所发生的形态改变十分的相似[11。为检测D69对非肿瘤细胞的毒性，以人永生化乳腺上皮细胞HMEC为模型，在倒置光学显微镜下观察D69处理后的细胞生长情况及形态学变化，发现与对照组相比，D69对HMEC细胞生长的抑制作用较人乳腺癌细胞MDA-MB-435和ZR-75-30要小得多（见图3）。
2.3D69对MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞生长的抑制效应
MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞分别以不同浓度的D69处理48 h，MTT结果显示，D69以剂量依赖型的方式抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435和ZR-75-30的增殖。其中对MDA-MB-435细胞的抑制率最高，其作用48 h后的IC50为0.031 μmol/L。其次是ZR-75-30细胞，IC50为0.036 μmol/L，而D69对于人永生化乳腺上皮细胞HMEC的抑制率最低，IC50为0.686 μmol/L，见图4
2.4裸鼠异体移植瘤模型中D69的体内抗肿瘤作用
体内抗肿瘤实验证明，与对照组相比，给药组能显着地抑制肿瘤的生长，其肿瘤抑制率为81.11%，差异具有显着性，对肿瘤的抑制效果更为明显。实验过程中，小鼠的体质量并没有明显的改变。见图5、表1。[PSa6684;S*2〗图4D69对MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞生长的剂量-效应曲线。
动物医学专业导论论文 http://www.qikanba.com/
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，自20世纪50年代始，随着光谱学、高通量筛选以及结构分析技术等的发展，已从海洋生物中分离筛选到如ecteinascidin-743、aplidine、bryostatin 1、黑麦酮酸D素等多种具有结构多样且效果较好的抗肿瘤活性物质 [4-8]。D69是从海洋源性的一株链霉菌菌株的次生代谢产物中分离得到的一种化合物，含有环状的五肽内酯环和发色基团，属于新型的黑麦酮酸D衍生物。通过对其体内外具有潜在的抗肿瘤活性的研究，从细胞和分子水平上初步探讨D69对人乳腺癌细胞生长的抑制作用和诱导凋亡作用，为进一步开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞株人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和ZR-75-30、人永生化乳腺上皮细胞系HMEC（human mammary epithelial cell）均为本实验室保存，并已在本实验室已发表的其他研究项目中使用[9]。
1.1.2化合物D69由中山大学化学与化学工程学院林永成教授提供。其结构运用核磁共振（H-NMR、13C-NMR、 HSQC、HMBC）、高分辨质谱 （ESI-MS ）等进行初步鉴定[10]。各种化合物由二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）制备保存母液。
1.1.3实验动物清洁级雌性BALB/c裸鼠，体质量18～20 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK（粤）2008-0020，粤监证字：2008A004。在中山大学实验动物中心动物实验部以SPF条件饲养，实验动物许可证号：SYXK（粤）2007-0081。
1.2方法
1.2.1细胞培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-435和ZR-75-30培养于含5%（φ）胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L HEPES、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5%（φ）CO2孵箱中孵育培养；传代时先用1× PBS清洗细胞，再用含0.02%EDTA的0.05 %胰酶消化，以DMEM完全培养基终止消化。人乳腺上皮细胞HMEC培养于无血清KSFM培养基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培养；传代时用上述胰酶消化，以胰酶抑制剂终止消化。以上细胞培养相关试剂均为Invitrogen/Gibco公司产品，胎牛血清购自Hyclone公司。
1.2.2四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞增殖将MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞消化后重悬并计数，按每孔1.0×104个细胞分别接种至96孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育培养。24 h后去除培养基，更换为含浓度依次为0、0 001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4 μmol/L D69的培养基，每个浓度均设3个平行复孔，继续培养48 h后，显微镜下观察细胞形态及生长的变化。随后每孔加入5 mg/mL MTT （Genview公司，用1×磷酸盐缓冲液溶解，终质量浓度5 mg/mL，过滤除菌，分装后-20 ℃避光保存）溶液20 μL，37 ℃作用4 h，离心后弃上清液，加入DMSO 150 μL,振荡器振荡10 min充分溶解结晶，置酶标仪上测定波长为570 nm下的吸光度A值。细胞生长抑制率（%）=（对照组平均A值-实验组平均A值）/对照组平均A值×100 %。对照组即D69浓度为0的培养孔。使用半数抑制浓度（IC50）计算软件Bliss's software计算IC50，应用SPSS软件进行数据统计分析。
1.2.3D69抑制人乳腺癌细胞系MDA-MB-435生长的体内实验每只BALB/c裸鼠右侧乳腺接种数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-435细胞5×106（100 μL）。接种肿瘤后第6天，将14只裸鼠随机等分为2组。待瘤直径在30~50 mm后，以30 μg/kg剂量的D69，每2天腹腔注射给药1次，持续30 d，观察并记录D69的体内抑瘤作用。肿瘤体积计算公式：体积（mm3）=长径×短径2×π/6。根据各组皮下移植瘤体积，计算各个时间点肿瘤体积的均数值并绘制肿瘤生长曲线。D69注射29 d后，处死，迅速取下肿瘤标本，称重。抑制率=（1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。所有动物实验操作均遵守《实验动物管理条例》（中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号，1988）。
2结果
2.1D69对人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、ZR-75-30生长和形态的影响
在倒置光学显微镜下观察D69处理后细胞生长情况及形态学变化，发现D69对于人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、ZR-75-30的生长具有显着的抑制作用（见图1、2）。随着D69浓度的增加，细胞生长抑制及细胞死亡现象越来越明显，出现大面积的脱落，细胞及细胞碎片漂浮液面。这种细胞形态的改变与细胞凋亡所发生的形态改变十分的相似[11。为检测D69对非肿瘤细胞的毒性，以人永生化乳腺上皮细胞HMEC为模型，在倒置光学显微镜下观察D69处理后的细胞生长情况及形态学变化，发现与对照组相比，D69对HMEC细胞生长的抑制作用较人乳腺癌细胞MDA-MB-435和ZR-75-30要小得多（见图3）。
2.3D69对MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞生长的抑制效应
MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞分别以不同浓度的D69处理48 h，MTT结果显示，D69以剂量依赖型的方式抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-435和ZR-75-30的增殖。其中对MDA-MB-435细胞的抑制率最高，其作用48 h后的IC50为0.031 μmol/L。其次是ZR-75-30细胞，IC50为0.036 μmol/L，而D69对于人永生化乳腺上皮细胞HMEC的抑制率最低，IC50为0.686 μmol/L，见图4
2.4裸鼠异体移植瘤模型中D69的体内抗肿瘤作用
体内抗肿瘤实验证明，与对照组相比，给药组能显着地抑制肿瘤的生长，其肿瘤抑制率为81.11%，差异具有显着性，对肿瘤的抑制效果更为明显。实验过程中，小鼠的体质量并没有明显的改变。见图5、表1。[PSa6684;S*2〗图4D69对MDA-MB-435、ZR-75-30和HMEC细胞生长的剂量-效应曲线。
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