杜鹃花叶片总RNA的提取方法优化实验-口腔根管治疗论文
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1 材料与仪器
1.1 试剂与仪器提取液配方：2%CTAB（W/V），4%PVP（W/V），100mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0），25 mmol·L-1EDTA（pH 8.0），5 mol·L-1NaCl，混匀灭菌121℃，15 min，灭菌后加入体积分数2%的2-硫基乙醇。 DEPC购自Amresco公司；琼脂糖购自Sigma 公司；rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa（大连）有限公司；引物由Invitrogen公司合成。其他试剂均为国产分析纯。
冷冻离心机：Centrifuge 5804 R（Eppendorf 公司）；电泳仪：DYY-Ⅲ 1型稳压仪（北京六一仪器厂）；紫外凝胶成像系统：Bio IMAGING SYSTEM（SYNGENE）；紫外可见分光光度计：TU-1800（北京普析通用仪器有限责任公司）；PCR 仪：Personalcycler （Biometra 公司）。
1.2 材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇淋，于-70 ℃贮存备用。
2 方法
2.1 几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总RNARNA plant试剂提取法：试剂购自TIANGEN公司，实验操作按照说明书进行；TRI Reagent 试剂提取法：试剂购自Ambion公司，实验操作按照说明书进行；RNeasy Plant Mini Kit试剂提取法：试剂购自QIAGEN公司，试验操作按照说明书进行。
2.2 改良CTAB法提取程序：①称取100 mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入1.5 ml离心管内，加入65℃预热的0.75ml提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20 min。
②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10min。③上清转入新的无RNase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5 mol·L-1 NaCl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑤上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，小心倒掉上清液；加入1 ml 70%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1离心1 min，小心倒掉上清液；加入30～50 μl DEPC处理水溶解沉淀。⑥加入DNase I（10 U·μl-1）1 μl混匀，37℃温浴30 min。⑦加入100 μl DEPC处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提一次 ，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑧吸上清液，加入1 ml无水乙醇， -20℃静置2 h。⑨4℃，12 000 r·min-1离心5 min弃上清液，用70%的乙醇洗涤。⑩4℃，12 000 r·min-1离心10 min弃上清，干燥后加入20μl DEPC处理水保存备用。
2.3 RNA完整性与质量检测使用各种方法提取时，样品的起始量均为100 mg，得到的RNA样品都稀释10倍后取1 μl进行非变性琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中观察提取的RNA完整性。取1 μl样品，稀释50倍，紫外分光光度计测量其在230 nm，260 nm，280 nm处的紫外吸光值（A）。计算A260 nm/A280 nm，A260 nm/A230 nm用于纯度分析。
2.4 杜鹃花 hsp70基因cDNA 核心片段的克隆根据已知植物hsp70基因核甘酸序列（mRNA）的保守区域设计合成下述4个正向或反向简并引物做巢式PCR。外测为C1: 5'-GGNATHGAYYTNGGNACN- 3‘，C2: 5'- NCCNGCRTC YTTNGTNGC -3’；内测为D1: 5'-GAYCARGGNAAYMGNACNACNCC-3‘，D2: 5'-RTCRTT RAARTANGCNGGNAC-3’。预期PCR产物片段大小为350 bp左右。以上述cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行巢式PCR扩增，以引物C1，C2进行巢式PCR的首轮扩增，反应体系为cDNA 1 μl 、10×PCR 缓冲液（无Mg2+）2 μl 、dNTP （2.5 mmol· L-1） 2.4 μl 、rTaq 酶0.25 μl （2 U·L-1），以及C1、C2（100 mol·L-1）各1 μl，Mg2+（25 mmol·L-1）2.4 μl，加ddH2O 至20 μl。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，49 ℃ 50 s ，72 ℃ 1 min ，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 取首次扩增产物1 μl，稀释20 倍作为第2轮扩增的模板，用引物D1、D2进行巢式PCR的第二轮扩增，反应体系与巢式PCR的首轮扩增相同，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s ，72 ℃1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
3 结果
3.1 RNA完整性分析通过琼脂糖凝胶电泳可以直观地看到（见图1），改良CTAB法提取的杜鹃花叶片总RNA，条带清晰，完整，不拖尾（泳道1，2），说明在该方法中RNA很少降解。而RNAplant试剂提取的RNA （泳道3，4），在初始加入材料量相同的情况下，条带较暗也就是得率较低。而TRI Reagent 试剂盒和RNeasy Plant Mini Kit 试剂盒均未能提取得到杜鹃花叶片总RNA。PCR验证以改良CTAB法提取的RNA进行反转录产物为模板，用18S A，18S B为引物进行PCR。实验结果表明，能成功地扩增出长度为110 bp左右的目的片段。这进一步说明本实验法提取的RNA样品完整，可以用于后续试验（见图2）。
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1 材料与仪器
1.1 试剂与仪器提取液配方：2%CTAB（W/V），4%PVP（W/V），100mmol·L-1Tris-HCl（pH8.0），25 mmol·L-1EDTA（pH 8.0），5 mol·L-1NaCl，混匀灭菌121℃，15 min，灭菌后加入体积分数2%的2-硫基乙醇。 DEPC购自Amresco公司；琼脂糖购自Sigma 公司；rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa（大连）有限公司；引物由Invitrogen公司合成。其他试剂均为国产分析纯。
冷冻离心机：Centrifuge 5804 R（Eppendorf 公司）；电泳仪：DYY-Ⅲ 1型稳压仪（北京六一仪器厂）；紫外凝胶成像系统：Bio IMAGING SYSTEM（SYNGENE）；紫外可见分光光度计：TU-1800（北京普析通用仪器有限责任公司）；PCR 仪：Personalcycler （Biometra 公司）。
1.2 材料多年生杜鹃花叶片采自龙池华西亚高山杜鹃园，采下后立即用液氮浇淋，于-70 ℃贮存备用。
2 方法
2.1 几种试剂盒法提取杜鹃花叶片总RNARNA plant试剂提取法：试剂购自TIANGEN公司，实验操作按照说明书进行；TRI Reagent 试剂提取法：试剂购自Ambion公司，实验操作按照说明书进行；RNeasy Plant Mini Kit试剂提取法：试剂购自QIAGEN公司，试验操作按照说明书进行。
2.2 改良CTAB法提取程序：①称取100 mg的杜鹃花叶片，迅速放入液氮研磨至粉末状，转入1.5 ml离心管内，加入65℃预热的0.75ml提取液，涡旋振荡混匀后65℃温浴20 min。
②加入与提取液等体积的水饱和酚，振荡摇匀，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10min。③上清转入新的无RNase离心管；加入与提取液等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混匀，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。④吸上清装入新的离心管里，加入1/2上清体积5 mol·L-1 NaCl，摇晃混匀，再加入1/2体积氯仿，振荡混匀，4 ℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑤上清液转入新的无RNase离心管并加入等体积的异丙醇，温和混匀后室温放置10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，小心倒掉上清液；加入1 ml 70%乙醇，4 ℃ 12 000 r·min-1离心1 min，小心倒掉上清液；加入30～50 μl DEPC处理水溶解沉淀。⑥加入DNase I（10 U·μl-1）1 μl混匀，37℃温浴30 min。⑦加入100 μl DEPC处理水稀释后，再加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提一次 ，4℃，12 000 r·min-1离心10 min。⑧吸上清液，加入1 ml无水乙醇， -20℃静置2 h。⑨4℃，12 000 r·min-1离心5 min弃上清液，用70%的乙醇洗涤。⑩4℃，12 000 r·min-1离心10 min弃上清，干燥后加入20μl DEPC处理水保存备用。
2.3 RNA完整性与质量检测使用各种方法提取时，样品的起始量均为100 mg，得到的RNA样品都稀释10倍后取1 μl进行非变性琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶成像系统中观察提取的RNA完整性。取1 μl样品，稀释50倍，紫外分光光度计测量其在230 nm，260 nm，280 nm处的紫外吸光值（A）。计算A260 nm/A280 nm，A260 nm/A230 nm用于纯度分析。
2.4 杜鹃花 hsp70基因cDNA 核心片段的克隆根据已知植物hsp70基因核甘酸序列（mRNA）的保守区域设计合成下述4个正向或反向简并引物做巢式PCR。外测为C1: 5'-GGNATHGAYYTNGGNACN- 3‘，C2: 5'- NCCNGCRTC YTTNGTNGC -3’；内测为D1: 5'-GAYCARGGNAAYMGNACNACNCC-3‘，D2: 5'-RTCRTT RAARTANGCNGGNAC-3’。预期PCR产物片段大小为350 bp左右。以上述cDNA为模板，用Taq DNA聚合酶进行巢式PCR扩增，以引物C1，C2进行巢式PCR的首轮扩增，反应体系为cDNA 1 μl 、10×PCR 缓冲液（无Mg2+）2 μl 、dNTP （2.5 mmol· L-1） 2.4 μl 、rTaq 酶0.25 μl （2 U·L-1），以及C1、C2（100 mol·L-1）各1 μl，Mg2+（25 mmol·L-1）2.4 μl，加ddH2O 至20 μl。扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，49 ℃ 50 s ，72 ℃ 1 min ，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 取首次扩增产物1 μl，稀释20 倍作为第2轮扩增的模板，用引物D1、D2进行巢式PCR的第二轮扩增，反应体系与巢式PCR的首轮扩增相同，扩增条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，50 ℃ 50 s ，72 ℃1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。
3 结果
3.1 RNA完整性分析通过琼脂糖凝胶电泳可以直观地看到（见图1），改良CTAB法提取的杜鹃花叶片总RNA，条带清晰，完整，不拖尾（泳道1，2），说明在该方法中RNA很少降解。而RNAplant试剂提取的RNA （泳道3，4），在初始加入材料量相同的情况下，条带较暗也就是得率较低。而TRI Reagent 试剂盒和RNeasy Plant Mini Kit 试剂盒均未能提取得到杜鹃花叶片总RNA。PCR验证以改良CTAB法提取的RNA进行反转录产物为模板，用18S A，18S B为引物进行PCR。实验结果表明，能成功地扩增出长度为110 bp左右的目的片段。这进一步说明本实验法提取的RNA样品完整，可以用于后续试验（见图2）。
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