黄芩苷作用T细胞表面的可能受体研究-关于医学的论文
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1 材料与仪器
1.1 细胞及药品人外周血浓缩白细胞购自江西省血液中心，黄芩苷由江西省中医药研究所提供（纯度＞98%）。
1.2 试剂及仪器鼠抗人TCR（αβ）单克隆抗体（美国BD公司），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI 公司），Trizol试剂、SYBR Green qPCR试剂盒，MyiQ实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）。
1.3 qPCR引物由Primier Primer 5.0 软件设计，上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin（β-肌动蛋白）为内参基因，序列如下：
TCRvβ （XM_001716513） 141bp Forward 5'-GGGGCTGAGGCTGATT-3' Reverse 5'-ACAGATGTTTGGGAGGGA-3'
β-actin （NM_001101） 128bp Forward 5'-TGTGACGTGGACATCCG-3' Reverse 5'-ATCTTCATTGTGCTGGGTG-3'
2 方法
2.1 T细胞分离参见文献［5］应用密度梯度离心法从血浓缩白细胞中分离PBMC，再利用玻璃贴壁法去除单核细胞，最后将收集的淋巴细胞用尼龙毛柱法分离T细胞。洗涤收集的T细胞，用0.2%台 蓝染色计数细胞活率（≥95%），补体依赖细胞毒实验（CDC）鉴定T细胞纯度（≥90%），最后调整细胞浓度为5×106/ml。
2.2 实验分组按表1分组加样后转种于24孔板上，置37℃ 5%CO2箱培养48 h。
2.3 总RNA提取及鉴定①利用Trizol试剂提取总RNA。②100V、1%琼脂糖凝胶电泳观察总RNA完整性。③紫外分光光度计测定OD260/OD280，在1.80～2.0之间，说明纯度较好，并计算总RNA的浓度。
2.4 实时荧光定量RT-PCR以5μg总RNA为模板按试剂说明书逆转录为第一链cDNA，逆转录反应体系为20 μl。qPCR反应体系为50 μl：cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、SuperMix 25 μl、SYBR Green Dye 1μl、Mg2+ 2μl补足双蒸水至50 μl。每个样本做3个复孔，取三孔的平均值分析。qPCR扩增程序：Cycle 1: （ 1×） 95.0℃for 05:00; Cycle 2: （ 45×） 95.0℃for 00:15 ,53.0℃for 00:30 , 72.0℃for 00:30，72.0℃延升阶段收集荧光信号。循环结束后增加熔点曲线程序以观察产物特异性：Cycle 3: （1×）： 95.0℃for 01:00; Cycle 4: （1×） 55.0℃for 01:00; Cycle 5:（ 80×） 55.0℃for 00:30,每个循环升温0.5℃并收集荧光信号。
2.5 统计分析利用livak法［6］即2 – ΔΔCt来计算各实验组相对于空白对照组的TCRvβ相对表达量，以β-actin作为校正基因，ΔΔCt=（CtTCRvβ-Ctβ-actin）实验组-（CtTCRvβ-Ctβ-actin）T1。各组数据以mean±s的形式描述，并利用SPSS17.0做单因素方差分析（方差齐性检验、SNK多重比较），P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 qPCR扩增结果图1～4。熔解曲线结果显示TCRvβ、β-actin分别在86℃，89℃附近出现单峰，与产物解链温度吻合，表明引物设计合理具有特异性。根据扩增Ct值按公式2 – ΔΔCt计算得到T1，T2，T3，T4组的TCRvβmRNA相对表达比率分别是1.0，（4.388±0.917），（1.717±0.493），（1.040±0.293），表明T2组TCRvβmRNA表达较T1组明显增加，而T3组TCRvβmRNA表达较T2组明显抑制，但较T4组仍有增加。
3.2 各实验组TCR vβ mRNA相对表达比率见图5。将计算所得的各组TCR vβ mRNA相对表达率做ANVOA统计分析，结果表明T2组较T1组TCR Vβ mRNA的表达明显增强（p 0.01）； T3组较T2组TCR Vβ mRNA的表达明显减低（p 0.01）；T3组较T4组TCR Vβ mRNA的表达增高（p>0.05）。
医学论文摘要 http://www.qikanba.com/
1 材料与仪器
1.1 细胞及药品人外周血浓缩白细胞购自江西省血液中心，黄芩苷由江西省中医药研究所提供（纯度＞98%）。
1.2 试剂及仪器鼠抗人TCR（αβ）单克隆抗体（美国BD公司），RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（MBI 公司），Trizol试剂、SYBR Green qPCR试剂盒，MyiQ实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）。
1.3 qPCR引物由Primier Primer 5.0 软件设计，上海生工生物工程有限公司合成。以β-actin（β-肌动蛋白）为内参基因，序列如下：
TCRvβ （XM_001716513） 141bp Forward 5'-GGGGCTGAGGCTGATT-3' Reverse 5'-ACAGATGTTTGGGAGGGA-3'
β-actin （NM_001101） 128bp Forward 5'-TGTGACGTGGACATCCG-3' Reverse 5'-ATCTTCATTGTGCTGGGTG-3'
2 方法
2.1 T细胞分离参见文献［5］应用密度梯度离心法从血浓缩白细胞中分离PBMC，再利用玻璃贴壁法去除单核细胞，最后将收集的淋巴细胞用尼龙毛柱法分离T细胞。洗涤收集的T细胞，用0.2%台 蓝染色计数细胞活率（≥95%），补体依赖细胞毒实验（CDC）鉴定T细胞纯度（≥90%），最后调整细胞浓度为5×106/ml。
2.2 实验分组按表1分组加样后转种于24孔板上，置37℃ 5%CO2箱培养48 h。
2.3 总RNA提取及鉴定①利用Trizol试剂提取总RNA。②100V、1%琼脂糖凝胶电泳观察总RNA完整性。③紫外分光光度计测定OD260/OD280，在1.80～2.0之间，说明纯度较好，并计算总RNA的浓度。
2.4 实时荧光定量RT-PCR以5μg总RNA为模板按试剂说明书逆转录为第一链cDNA，逆转录反应体系为20 μl。qPCR反应体系为50 μl：cDNA 1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、SuperMix 25 μl、SYBR Green Dye 1μl、Mg2+ 2μl补足双蒸水至50 μl。每个样本做3个复孔，取三孔的平均值分析。qPCR扩增程序：Cycle 1: （ 1×） 95.0℃for 05:00; Cycle 2: （ 45×） 95.0℃for 00:15 ,53.0℃for 00:30 , 72.0℃for 00:30，72.0℃延升阶段收集荧光信号。循环结束后增加熔点曲线程序以观察产物特异性：Cycle 3: （1×）： 95.0℃for 01:00; Cycle 4: （1×） 55.0℃for 01:00; Cycle 5:（ 80×） 55.0℃for 00:30,每个循环升温0.5℃并收集荧光信号。
2.5 统计分析利用livak法［6］即2 – ΔΔCt来计算各实验组相对于空白对照组的TCRvβ相对表达量，以β-actin作为校正基因，ΔΔCt=（CtTCRvβ-Ctβ-actin）实验组-（CtTCRvβ-Ctβ-actin）T1。各组数据以mean±s的形式描述，并利用SPSS17.0做单因素方差分析（方差齐性检验、SNK多重比较），P<0.05为有统计学意义。
3 结果
3.1 qPCR扩增结果图1～4。熔解曲线结果显示TCRvβ、β-actin分别在86℃，89℃附近出现单峰，与产物解链温度吻合，表明引物设计合理具有特异性。根据扩增Ct值按公式2 – ΔΔCt计算得到T1，T2，T3，T4组的TCRvβmRNA相对表达比率分别是1.0，（4.388±0.917），（1.717±0.493），（1.040±0.293），表明T2组TCRvβmRNA表达较T1组明显增加，而T3组TCRvβmRNA表达较T2组明显抑制，但较T4组仍有增加。
3.2 各实验组TCR vβ mRNA相对表达比率见图5。将计算所得的各组TCR vβ mRNA相对表达率做ANVOA统计分析，结果表明T2组较T1组TCR Vβ mRNA的表达明显增强（p 0.01）； T3组较T2组TCR Vβ mRNA的表达明显减低（p 0.01）；T3组较T4组TCR Vβ mRNA的表达增高（p>0.05）。
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