黄芩苷抗肿瘤活性研究-关于医学的毕业论文
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黄芩是一种唇形科多年生草本植物的干燥根，作为药用已有上千年的历史，其味苦、性寒，具有清热解毒、凉血止血、除热安胎的功效。 其主要活性成分黄芩苷（分子式C21H18O11、分子量446.35）是一种黄酮类化合物，研究发现黄芩苷具有抗病毒［1］，抗炎症［2］，抗肿瘤［3］及免疫调节的作用［4］。其中对黄芩苷免疫调节机制的研究，尤其是抗病毒、抗肿瘤方面的免疫调节机制已成为学者们关注的热点问题之一，但目前的研究大多局限于细胞水平。本实验在本室既往摸索的黄芩苷最佳体外作用浓度及促进T、B细胞体外增殖研究的基础上，从黄芩苷对TCR vβ mRNA表达的影响入手，结合抗体封闭技术，试图从分子水平上探索黄芩苷作用T细胞表面的可能受体。
TCR即T 细胞受体是T细胞特异性识别抗原的受体，是所有T细胞的特征性表面标志，可分别由α、β链或γ、δ链构成异二聚体，外周血中以TCRαβ为主，αβ T细胞也是参与免疫应答的主要细胞群［7］。TCR α、β链分别由V（variable）-D（diversity）-J（junctinal）集合与C（constant）恒定区构成，在胸腺的分化过程中，每条链都经历了复杂的基因重组、重排过程。通过V-D-J区的随机重排、重组形成高度多样性的TCR，从而可以特异性识别环境中千变万化的抗原。作用TCR的抗原分普通抗原和超抗原，普通抗原即一般的蛋白质、多糖类抗原，经由抗原呈递细胞（APC）加工处理后形成抗原肽-MHC复合物表达APC表面，在CD4/CD8分子的辅助下与TCRα、β链特异性结合，由CD3分子将活化信号传入T细胞内，刺激T细胞发生特异性免疫应答。而某些逆转录病毒（如HIV）、细菌毒素类超抗原，则不需要APC加工处理可直接与MHC-Ⅱ、TCR Vβ分子结合活化T细胞，在某些细胞因子辅助下甚至不需要MHC-Ⅱ分子参与也可以经TCR Vβ途径活化T细胞。
国内外研究发现黄芩苷具有一定的抗HIV、HBV病毒作用以及抗肿瘤活性，因此考虑黄芩苷可能与病毒抗原有共同的作用途径。本实验从Genebank中选择了一段相似于人T细胞受体β链V区前体（T-cell receptor beta chain V region C5 precursor）的序列作为目标基因，以外周血T淋巴细胞为研究对象，分别设空白对照组（T1）、黄芩苷组（T2）、抗体封闭用药组（T3）以及抗体封闭对照组（T4），利用实时荧光RT-PCR检测各组细胞TCR Vβ目标基因的相对表达变化，我们的结果显示：黄芩苷能显着增加T细胞表面TCR Vβ的表达（p 0.01），提示黄芩苷可能是通过增加T细胞表面TCR Vβ的表达来增加T细胞的抗病毒及抗炎活性，并且这也可能与黄芩苷的抗肿瘤作用有关；其二抗TCR（αβ）单抗体封闭TCR后能明显抑制黄芩苷对TCR Vβ的影响（p 0.01），尽管抗体封闭后用黄芩苷干预TCR Vβ表达较抗体封闭对照组略有增高，但无明显统计学意义（P>0.05），提示TCR可能是黄芩苷作用于T细胞的主要受体之一。此外，抗体封闭组TCR Vβ表达较空白组略有升高（P>0.05），这表明抗TCR（αβ）抗体对T细胞有一定的刺激作用，其机制可能与抗TCR（αβ）抗体结合TCR后诱导TCR相互交连，促使TCR活化有关。
近年来利用多重PCR检测TCR vβ家族谱变化在对自身免疫性疾病、感染性疾病的免疫发病机制方面的研究报道较多，Jae seonlee等［8］研究发现胶原诱导大鼠的类风湿关节炎模型中，从大鼠淋巴结引流液中检测出CD+4T细胞 Vβ+3亚型明显增加，并证实此亚型T细胞可诱导其它非应答T淋巴细胞群发生免疫应答，其可能是类风湿关节炎发病机制之一。 Monica Kharbanda等［9］研究发现在儿童HIV病毒感染患者中常伴随有明显的TCR Vβ谱变化，其中55% CD+8TCR Vβ表达增强，这可能与促进CD+8T细胞对病毒的细胞毒性作用有关。
Jorge Clare＾ncio等［10］研究发现利什曼原虫疫苗接种志愿者外周血CD+4，CD+8TCR Vβ表达均增强，并证实TCR Vβ12的表达与IFN-γ的分泌、T细胞的活化有关。这些均说明TCR Vβ在抗感染免疫中有活化T细胞、增加CD+8T细胞的细胞毒作用以及促进抗病毒细胞因子分泌的作用。王辉等［11］研究还发现肝癌患者也伴随有特异性的TCR Vβ7.1表达降低，通过质粒构建将该TCR Vβ基因转染入人外周血淋巴细胞后可明显增加外周血淋巴细胞的抗肿瘤活性，诱导肿瘤细胞凋亡。
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黄芩是一种唇形科多年生草本植物的干燥根，作为药用已有上千年的历史，其味苦、性寒，具有清热解毒、凉血止血、除热安胎的功效。 其主要活性成分黄芩苷（分子式C21H18O11、分子量446.35）是一种黄酮类化合物，研究发现黄芩苷具有抗病毒［1］，抗炎症［2］，抗肿瘤［3］及免疫调节的作用［4］。其中对黄芩苷免疫调节机制的研究，尤其是抗病毒、抗肿瘤方面的免疫调节机制已成为学者们关注的热点问题之一，但目前的研究大多局限于细胞水平。本实验在本室既往摸索的黄芩苷最佳体外作用浓度及促进T、B细胞体外增殖研究的基础上，从黄芩苷对TCR vβ mRNA表达的影响入手，结合抗体封闭技术，试图从分子水平上探索黄芩苷作用T细胞表面的可能受体。
TCR即T 细胞受体是T细胞特异性识别抗原的受体，是所有T细胞的特征性表面标志，可分别由α、β链或γ、δ链构成异二聚体，外周血中以TCRαβ为主，αβ T细胞也是参与免疫应答的主要细胞群［7］。TCR α、β链分别由V（variable）-D（diversity）-J（junctinal）集合与C（constant）恒定区构成，在胸腺的分化过程中，每条链都经历了复杂的基因重组、重排过程。通过V-D-J区的随机重排、重组形成高度多样性的TCR，从而可以特异性识别环境中千变万化的抗原。作用TCR的抗原分普通抗原和超抗原，普通抗原即一般的蛋白质、多糖类抗原，经由抗原呈递细胞（APC）加工处理后形成抗原肽-MHC复合物表达APC表面，在CD4/CD8分子的辅助下与TCRα、β链特异性结合，由CD3分子将活化信号传入T细胞内，刺激T细胞发生特异性免疫应答。而某些逆转录病毒（如HIV）、细菌毒素类超抗原，则不需要APC加工处理可直接与MHC-Ⅱ、TCR Vβ分子结合活化T细胞，在某些细胞因子辅助下甚至不需要MHC-Ⅱ分子参与也可以经TCR Vβ途径活化T细胞。
国内外研究发现黄芩苷具有一定的抗HIV、HBV病毒作用以及抗肿瘤活性，因此考虑黄芩苷可能与病毒抗原有共同的作用途径。本实验从Genebank中选择了一段相似于人T细胞受体β链V区前体（T-cell receptor beta chain V region C5 precursor）的序列作为目标基因，以外周血T淋巴细胞为研究对象，分别设空白对照组（T1）、黄芩苷组（T2）、抗体封闭用药组（T3）以及抗体封闭对照组（T4），利用实时荧光RT-PCR检测各组细胞TCR Vβ目标基因的相对表达变化，我们的结果显示：黄芩苷能显着增加T细胞表面TCR Vβ的表达（p 0.01），提示黄芩苷可能是通过增加T细胞表面TCR Vβ的表达来增加T细胞的抗病毒及抗炎活性，并且这也可能与黄芩苷的抗肿瘤作用有关；其二抗TCR（αβ）单抗体封闭TCR后能明显抑制黄芩苷对TCR Vβ的影响（p 0.01），尽管抗体封闭后用黄芩苷干预TCR Vβ表达较抗体封闭对照组略有增高，但无明显统计学意义（P>0.05），提示TCR可能是黄芩苷作用于T细胞的主要受体之一。此外，抗体封闭组TCR Vβ表达较空白组略有升高（P>0.05），这表明抗TCR（αβ）抗体对T细胞有一定的刺激作用，其机制可能与抗TCR（αβ）抗体结合TCR后诱导TCR相互交连，促使TCR活化有关。
近年来利用多重PCR检测TCR vβ家族谱变化在对自身免疫性疾病、感染性疾病的免疫发病机制方面的研究报道较多，Jae seonlee等［8］研究发现胶原诱导大鼠的类风湿关节炎模型中，从大鼠淋巴结引流液中检测出CD+4T细胞 Vβ+3亚型明显增加，并证实此亚型T细胞可诱导其它非应答T淋巴细胞群发生免疫应答，其可能是类风湿关节炎发病机制之一。 Monica Kharbanda等［9］研究发现在儿童HIV病毒感染患者中常伴随有明显的TCR Vβ谱变化，其中55% CD+8TCR Vβ表达增强，这可能与促进CD+8T细胞对病毒的细胞毒性作用有关。
Jorge Clare＾ncio等［10］研究发现利什曼原虫疫苗接种志愿者外周血CD+4，CD+8TCR Vβ表达均增强，并证实TCR Vβ12的表达与IFN-γ的分泌、T细胞的活化有关。这些均说明TCR Vβ在抗感染免疫中有活化T细胞、增加CD+8T细胞的细胞毒作用以及促进抗病毒细胞因子分泌的作用。王辉等［11］研究还发现肝癌患者也伴随有特异性的TCR Vβ7.1表达降低，通过质粒构建将该TCR Vβ基因转染入人外周血淋巴细胞后可明显增加外周血淋巴细胞的抗肿瘤活性，诱导肿瘤细胞凋亡。
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