活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑组织VEGF mRNA 表达的影响分析-关于预防亚健康的论文
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1 材料与仪器
1.1 动物健康雄性Wistar大鼠，体质量200～250g，山东鲁抗医药有限公司提供［合格证号：SCXK（鲁）20050017］。
1.2 药物活血熄风方，由当归、红花、川芎、水蛭等药物组成，蒸馏水浸泡1 h，水煎2次，30 min/次，两次煎液混匀，旋转蒸发仪分别浓缩至2，1，0.5 g·ml-1，4℃保存备用。尼莫地平片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产，每片20 mg，使用前用蒸馏水溶解成含量为2 mg·ml-1的混悬液。
1.3 试剂与仪器Trizol Reagent（美国 Invitrogen）；DNA Marker DL2000、Taq 酶、Ribonuclease inhibitor、dNTP Mixture（大连宝生物）；M-MLV Reverse Transcriptase（美国 Promega）；玫瑰红（美国Sigma） ；红四氮唑（TTC） （化学纯，北京化工厂）。梯度PCR系统（ICYCLER型，美国BIO-RAD公司）；DXY-2稳压稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（Gel Doc 2000型，美国BIO-RAD公司）；低温高速离心机（Sigma3k30，德国Sigma公司）；紫外分光光度仪（UV-1601 型，日本岛津）；立体定位仪（美国Stoelting公司）；IPP图像采集分析系统（美国）。
2 方法
2.1 分组与给药大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、活血熄风方高剂量组、活血熄风方中剂量组、活血熄风低剂量组、尼莫地平对照组，每组12只，其中6只用于TTC染色，6只用于RT-PCR。各组均给予手术造模，假手术组股静脉注射药物为生理盐水，其余操作同模型组。各组造模前7 d灌胃给药，活血熄风方高、中、低剂量组分别给予活血熄风方20，10，5 g·kg-1·d-1，对照组给予尼莫地平0.02 g·kg-1·d-1，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。1次/d，末次给药1 h后造模。
2.2 局灶性脑缺血性大鼠模型的制备采用光化学法诱导制备局灶性脑缺血性大鼠模型，根据Waston等［5］的方法略加改动，具体方法如下：室温25℃条件下，雄性Wistar大鼠10%水合氯醛（0.35 g·kg-1）麻醉，立体定位仪固定大鼠头部，常规消毒后，沿头正中切口分离至暴露完整的颅骨，以矢状缝右侧3 mm，冠状缝后3 mm为中心用牙科平钻开直径约6 mm的骨窗，去除颅骨表层骨板，保留下层骨板及硬脑膜，经股静脉缓慢注入5%玫瑰红80 mg·kg-1，时间为1 min，注射结束5 min后用冷光源照射骨窗20 min。
2.3 TTC染色测脑梗塞灶体积造模后24 h，大鼠麻醉后迅速断头取脑，预冷生理盐水冲洗残血，去掉嗅球、小脑和低位脑干，-20℃冰冻脑组织20 min，在视交叉处冠状位切脑，其后间隔2 mm连续做6个冠状切片，迅速放入2% TTC溶液中，37℃恒温孵育20 min，染色后置4%多聚甲醛中固定，正常组织为红色，缺血区为白色，24 h后用扫描仪将图像扫描输入电脑，采用图像采集处理系统软件测量梗塞灶面积，各脑片梗塞面积之和乘以厚度为总的梗塞体积。
2.4 RT-PCR法测脑组织VEGF mRNA表达大鼠造模后24 h，麻醉后迅速断头取脑，取缺血侧大脑顶叶皮层，液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。
2.4.1 总RNA 的提取用Trizol常规方法提取大脑皮层总RNA，紫外分光光度计260／280 nm测RNA浓度，1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。
2.4.2 半定量分析扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，在电压为 5V·cm-1及稳流的条件下进行电泳，用Quantity One分析软件进行光密度扫描，测定各组 PCR 产物密度值与内参照Arbp PCR 产物密度值。用各组目的基因片段（VEGF）密度值/内参基因片段（Arbp）密度值的比值进行比较。
3 结果
3.1 活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响大鼠脑组织经TTC染色后，除假手术组外均在照射区大脑皮层出现白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，边界清晰，冠状面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向侧脑室，深达皮质全层，表明造模成功。活血熄风方各剂量组及尼莫地平组脑梗塞灶体积均较模型组减小，统计学差异显着（P＜0.01）。活血熄风方各剂量组与尼莫地平对照组比较，无明显差异（P＞0.05）。活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑组织VEGF mRNA 表达的影响与假手术组比较，模型组 VEGF mRNA 表达有所升高（P＜0.01）。与模型组比较，活血熄风方各剂量组与尼莫地平组均可显着上调脑组织 VEGF mRNA的表达（P＜0.01），且活血熄风方各剂量组 VEGF mRNA 表达相对含量均明显高于尼莫地平对照组（P＜0.01）。
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1 材料与仪器
1.1 动物健康雄性Wistar大鼠，体质量200～250g，山东鲁抗医药有限公司提供［合格证号：SCXK（鲁）20050017］。
1.2 药物活血熄风方，由当归、红花、川芎、水蛭等药物组成，蒸馏水浸泡1 h，水煎2次，30 min/次，两次煎液混匀，旋转蒸发仪分别浓缩至2，1，0.5 g·ml-1，4℃保存备用。尼莫地平片，山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产，每片20 mg，使用前用蒸馏水溶解成含量为2 mg·ml-1的混悬液。
1.3 试剂与仪器Trizol Reagent（美国 Invitrogen）；DNA Marker DL2000、Taq 酶、Ribonuclease inhibitor、dNTP Mixture（大连宝生物）；M-MLV Reverse Transcriptase（美国 Promega）；玫瑰红（美国Sigma） ；红四氮唑（TTC） （化学纯，北京化工厂）。梯度PCR系统（ICYCLER型，美国BIO-RAD公司）；DXY-2稳压稳流电泳仪及电泳槽（北京六一仪器厂）；凝胶成像系统（Gel Doc 2000型，美国BIO-RAD公司）；低温高速离心机（Sigma3k30，德国Sigma公司）；紫外分光光度仪（UV-1601 型，日本岛津）；立体定位仪（美国Stoelting公司）；IPP图像采集分析系统（美国）。
2 方法
2.1 分组与给药大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、活血熄风方高剂量组、活血熄风方中剂量组、活血熄风低剂量组、尼莫地平对照组，每组12只，其中6只用于TTC染色，6只用于RT-PCR。各组均给予手术造模，假手术组股静脉注射药物为生理盐水，其余操作同模型组。各组造模前7 d灌胃给药，活血熄风方高、中、低剂量组分别给予活血熄风方20，10，5 g·kg-1·d-1，对照组给予尼莫地平0.02 g·kg-1·d-1，假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。1次/d，末次给药1 h后造模。
2.2 局灶性脑缺血性大鼠模型的制备采用光化学法诱导制备局灶性脑缺血性大鼠模型，根据Waston等［5］的方法略加改动，具体方法如下：室温25℃条件下，雄性Wistar大鼠10%水合氯醛（0.35 g·kg-1）麻醉，立体定位仪固定大鼠头部，常规消毒后，沿头正中切口分离至暴露完整的颅骨，以矢状缝右侧3 mm，冠状缝后3 mm为中心用牙科平钻开直径约6 mm的骨窗，去除颅骨表层骨板，保留下层骨板及硬脑膜，经股静脉缓慢注入5%玫瑰红80 mg·kg-1，时间为1 min，注射结束5 min后用冷光源照射骨窗20 min。
2.3 TTC染色测脑梗塞灶体积造模后24 h，大鼠麻醉后迅速断头取脑，预冷生理盐水冲洗残血，去掉嗅球、小脑和低位脑干，-20℃冰冻脑组织20 min，在视交叉处冠状位切脑，其后间隔2 mm连续做6个冠状切片，迅速放入2% TTC溶液中，37℃恒温孵育20 min，染色后置4%多聚甲醛中固定，正常组织为红色，缺血区为白色，24 h后用扫描仪将图像扫描输入电脑，采用图像采集处理系统软件测量梗塞灶面积，各脑片梗塞面积之和乘以厚度为总的梗塞体积。
2.4 RT-PCR法测脑组织VEGF mRNA表达大鼠造模后24 h，麻醉后迅速断头取脑，取缺血侧大脑顶叶皮层，液氮速冻后，-70℃冰箱保存备用。
2.4.1 总RNA 的提取用Trizol常规方法提取大脑皮层总RNA，紫外分光光度计260／280 nm测RNA浓度，1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA质量。
2.4.2 半定量分析扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，在电压为 5V·cm-1及稳流的条件下进行电泳，用Quantity One分析软件进行光密度扫描，测定各组 PCR 产物密度值与内参照Arbp PCR 产物密度值。用各组目的基因片段（VEGF）密度值/内参基因片段（Arbp）密度值的比值进行比较。
3 结果
3.1 活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响大鼠脑组织经TTC染色后，除假手术组外均在照射区大脑皮层出现白色梗塞灶，梗塞灶部位恒定，边界清晰，冠状面梗塞灶呈“碗形”，尖端指向侧脑室，深达皮质全层，表明造模成功。活血熄风方各剂量组及尼莫地平组脑梗塞灶体积均较模型组减小，统计学差异显着（P＜0.01）。活血熄风方各剂量组与尼莫地平对照组比较，无明显差异（P＞0.05）。活血熄风方对局灶性脑缺血大鼠脑组织VEGF mRNA 表达的影响与假手术组比较，模型组 VEGF mRNA 表达有所升高（P＜0.01）。与模型组比较，活血熄风方各剂量组与尼莫地平组均可显着上调脑组织 VEGF mRNA的表达（P＜0.01），且活血熄风方各剂量组 VEGF mRNA 表达相对含量均明显高于尼莫地平对照组（P＜0.01）。
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