沙枣黄酮抗自由基的作用价值分析-最新精神科护理论文
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1 材料
1.1 试剂乙醇（A.R），氢氧化钠（A.R），亚硝酸钠（A.R），硝酸铝（A.R），pH 8.2 Tris-HCl缓冲液（A.R），0.02%双氧水（A.R）；7 mmol· L-1邻苯三酚（A.R）；pH 7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS,A.R）；1.5 mmol· L-1邻二氮菲（A.R）；2×10-4mol·L-1的DPPH（二苯基苦基苯肼，Sigma公司生产）。
1.2 仪器TDL-5型低速台式离心机（上海隆拓仪器设备有限公司）；赛多利斯电子天平（德国Sartorius）；岛津UV-2401PC型紫外分光光度计（日本岛津公司生产）；R-200型旋转薄膜蒸发器（瑞士BUCHI ）；eppendorf手动可调程单道移液器（德国艾本德股份公司）；DL-360A型超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；SHZ-C型循环水真空泵（河南豫华仪器有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（陕西太康生物科技有限公司）。
2.2 自由基的生成及清除率的测定
2.2.1 羟自由基的生成及清除率的测定［4］精密量取2.0 ml PBS磷酸盐缓冲溶液 （pH=7.4，下同）和4.0 ml蒸馏水于试管中，混匀作空白参比管；精密量取2.0 ml PBS，1.0 ml邻二氮菲（1.5 mmol· L-1，下同）、1.0 ml FeSO4（1.5 mmol· L-1，下同）和2.0 ml蒸馏水于试管中，混匀作未损伤管；精密量取2.0 ml PBS，1.0 ml邻二氮菲，1.0 ml FeSO4，1.0 ml蒸馏水和1.0 ml H2O2（0.02%）于试管中，混匀作损伤管；精密量取2.0 ml PBS，1.0 ml样品液和3.0 ml蒸馏水于试管中，混匀作样品参比管；精密量取2.0 ml PBS、1.0 ml邻二氮菲，1.0 ml FeSO4，1.0 ml黄酮试样液和1.0 ml H2O2于试管中，混匀作样品管。将上述试管置于恒温水锅中，37℃保温60 min，于波长536 nm处测吸光度（A）值，每种处理重复5次，用其平均值按下式计算羟自由基清除率。以VitC作对照。羟自由基清除率（%）=［（A样品-A样参）-（A损伤-A空参）］/（A未损-A损伤）×100%
2.2.2 超氧阴离子自由基的生成及清除率的测定［5］采用邻苯三酚自氧化法，精密量取Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol· L-1，pH 8.2）4.5 ml和0.1 ml药液于试管中，混匀后在室温下平衡4 min，然后于325 nm处测定吸光值Aj；精密量取Tris-HCl缓冲溶液4.5 ml向其中加入3 ml邻苯三酚（7 mmol· L-1），反应平衡4 min，于325 nm处测得反应体系的吸光值A0。按照上述方法，精密量取4.5 ml Tris-HCl缓冲溶液和0.1 ml药液，混匀后在室温下放置4 min，立即加入3 ml邻苯三酚并开始计时，以10 mmol· L-1 HCl为参比，于325 nm处每隔30 s测定反应体系的吸光值A，共记录前6 min；实验重复5次，求其平均值。按下式计算超氧阴离子自由基清除率（I）。以VitC作对照。I（%）=［（A0－A－Aj）/A0］×100%
2.2.3 DPPH·自由基的生成及清除率的测定［6,7］取上述黄酮试样液2 ml及浓度为2×10-4 mol·L-1的DPPH溶液2ml先后加入同一具塞试管中，30 min后以样品提取溶剂为空白调零测定其吸光度Ai；测定2 ml浓度为2×10-4 mol·L-1的DPPH溶液与2 ml 70%乙醇混合液的吸光度Ac；再测定2 ml黄酮提取液与2 ml无水乙醇混合液的吸光度Aj,重复5次，求其平均值。根据下列公式计算沙枣黄酮提取液对DPPH的抑制率，即：抑制率（%）=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100 。
3 结果
沙枣黄酮对DPPH·自由基的清除作用 沙枣黄酮对DPPH·自由基的清除效果见图3以脂溶性抗氧化剂VitE作对照，研究了沙枣黄酮对DPPH·的清除作用。结果如图3。由图3可知，沙枣黄酮对DPPH·具有很明显的清除作用，且清除效果随着浓度的增加而增大，且远远高于同浓度的VitE。在浓度为0.025 mg·ml-1时，沙枣黄酮对DPPH·的清除率已经远超过60%。酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［2,3］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。但是关于沙枣黄酮抗氧化方面的研究尚未见报道。本研究将沙枣黄酮对 3种不同自由基的清除能力进行了一个较为全面、系统的研究，从而探讨沙枣黄酮的抗氧化作用，为进一步筛选天然植物抗氧化剂奠定了一定的基础。
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1.1 试剂乙醇（A.R），氢氧化钠（A.R），亚硝酸钠（A.R），硝酸铝（A.R），pH 8.2 Tris-HCl缓冲液（A.R），0.02%双氧水（A.R）；7 mmol· L-1邻苯三酚（A.R）；pH 7.4磷酸盐缓冲溶液（PBS,A.R）；1.5 mmol· L-1邻二氮菲（A.R）；2×10-4mol·L-1的DPPH（二苯基苦基苯肼，Sigma公司生产）。
1.2 仪器TDL-5型低速台式离心机（上海隆拓仪器设备有限公司）；赛多利斯电子天平（德国Sartorius）；岛津UV-2401PC型紫外分光光度计（日本岛津公司生产）；R-200型旋转薄膜蒸发器（瑞士BUCHI ）；eppendorf手动可调程单道移液器（德国艾本德股份公司）；DL-360A型超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；SHZ-C型循环水真空泵（河南豫华仪器有限公司）；HH-S型恒温水浴锅（陕西太康生物科技有限公司）。
2.2 自由基的生成及清除率的测定
2.2.1 羟自由基的生成及清除率的测定［4］精密量取2.0 ml PBS磷酸盐缓冲溶液 （pH=7.4，下同）和4.0 ml蒸馏水于试管中，混匀作空白参比管；精密量取2.0 ml PBS，1.0 ml邻二氮菲（1.5 mmol· L-1，下同）、1.0 ml FeSO4（1.5 mmol· L-1，下同）和2.0 ml蒸馏水于试管中，混匀作未损伤管；精密量取2.0 ml PBS，1.0 ml邻二氮菲，1.0 ml FeSO4，1.0 ml蒸馏水和1.0 ml H2O2（0.02%）于试管中，混匀作损伤管；精密量取2.0 ml PBS，1.0 ml样品液和3.0 ml蒸馏水于试管中，混匀作样品参比管；精密量取2.0 ml PBS、1.0 ml邻二氮菲，1.0 ml FeSO4，1.0 ml黄酮试样液和1.0 ml H2O2于试管中，混匀作样品管。将上述试管置于恒温水锅中，37℃保温60 min，于波长536 nm处测吸光度（A）值，每种处理重复5次，用其平均值按下式计算羟自由基清除率。以VitC作对照。羟自由基清除率（%）=［（A样品-A样参）-（A损伤-A空参）］/（A未损-A损伤）×100%
2.2.2 超氧阴离子自由基的生成及清除率的测定［5］采用邻苯三酚自氧化法，精密量取Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol· L-1，pH 8.2）4.5 ml和0.1 ml药液于试管中，混匀后在室温下平衡4 min，然后于325 nm处测定吸光值Aj；精密量取Tris-HCl缓冲溶液4.5 ml向其中加入3 ml邻苯三酚（7 mmol· L-1），反应平衡4 min，于325 nm处测得反应体系的吸光值A0。按照上述方法，精密量取4.5 ml Tris-HCl缓冲溶液和0.1 ml药液，混匀后在室温下放置4 min，立即加入3 ml邻苯三酚并开始计时，以10 mmol· L-1 HCl为参比，于325 nm处每隔30 s测定反应体系的吸光值A，共记录前6 min；实验重复5次，求其平均值。按下式计算超氧阴离子自由基清除率（I）。以VitC作对照。I（%）=［（A0－A－Aj）/A0］×100%
2.2.3 DPPH·自由基的生成及清除率的测定［6,7］取上述黄酮试样液2 ml及浓度为2×10-4 mol·L-1的DPPH溶液2ml先后加入同一具塞试管中，30 min后以样品提取溶剂为空白调零测定其吸光度Ai；测定2 ml浓度为2×10-4 mol·L-1的DPPH溶液与2 ml 70%乙醇混合液的吸光度Ac；再测定2 ml黄酮提取液与2 ml无水乙醇混合液的吸光度Aj,重复5次，求其平均值。根据下列公式计算沙枣黄酮提取液对DPPH的抑制率，即：抑制率（%）=［1-（Ai-Aj）/Ac］×100 。
3 结果
沙枣黄酮对DPPH·自由基的清除作用 沙枣黄酮对DPPH·自由基的清除效果见图3以脂溶性抗氧化剂VitE作对照，研究了沙枣黄酮对DPPH·的清除作用。结果如图3。由图3可知，沙枣黄酮对DPPH·具有很明显的清除作用，且清除效果随着浓度的增加而增大，且远远高于同浓度的VitE。在浓度为0.025 mg·ml-1时，沙枣黄酮对DPPH·的清除率已经远超过60%。酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用［2,3］。近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然低毒的特点倍受青睐，而黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。但是关于沙枣黄酮抗氧化方面的研究尚未见报道。本研究将沙枣黄酮对 3种不同自由基的清除能力进行了一个较为全面、系统的研究，从而探讨沙枣黄酮的抗氧化作用，为进一步筛选天然植物抗氧化剂奠定了一定的基础。
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