探讨短期应用重组人生长激素对机体Th1/Th2偏移的影响 医药类毕业论文
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研究显示，生长激素对人体免疫系统发育及调节具有重要作用,生长激素可增强机体的细胞免疫功能,促使NK细胞活性增强，使白细胞介素2(IL 2)和干扰素(IFN γ)表达增强[1]。NK细胞是Th1类细胞，IL 2和IFN γ是Th1类细胞因子，因此推测重组人生长激素可能促使机体免疫状态向Th1状态偏移。本研究以IL 2和IFN γ代表Th1类细胞因子，白细胞介素4(IL 4)和白细胞介素10(IL 10)代表Th2类细胞因子，通过逆转录聚合酶链反应(RT PCR)技术检测原发性肝癌术后短期应用重组人生长激素后外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2细胞因子的表达，探讨短期应用重组人生长激素在肝癌切除后对机体Th1/Th2偏移的影响，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
原发性肝癌病人36例，分为重组人生长激素组和单纯手术切除组。重组人生长激素组16例，男14例，女2例;年龄38～66岁，平均52.5岁;肝细胞性肝癌10例，胆管细胞性肝癌3例，混合细胞性肝癌3例;肿瘤直径4.4～8.2 cm; HBcAb(+)10例，HBsAg(+)10例，HBsAb(+)4例，HBeAg(+)1例，HBeAb(+)4例。单纯手术切除组20例，男16例，女4例;年龄39～61岁，平均49.8岁;肝细胞性肝癌18例，胆管细胞性肝癌2例;肿瘤直径3.3～10.3 cm;HBsAg(+)18例，HBsAb(+)2例，HBeAg(+)2例，HBeAb(+)10例，HBcAb(+)18例。
1.2 标本来源
所有病人均于术前和术后10 d采集肘静脉血4 mL,EDTAK2抗凝。
1.3 PBMC的提取
用淋巴细胞分离液离心分层法分离提取病人血标本中的PBMC。
1.4 PBMC总RNA的提取
异硫氰酸胍法提取PBMC中的总RNA。
1.5 聚合酶链反应(PCR)引物
4种细胞因子和β actin的引物序列见表1。均由上海博亚生物工程公司合成。
1.6 逆转录反应
M MLV逆转录酶购自美国GB CO公司。 5～10 μg总RNA加入5×buffer 4 μL，0.1 mol/L DDT 2 μL, M MLV 1 μL(200U), 4×dNTP(10 mmol/L,每种)1 μL，下游引物P2 (50 pmol/L)0.5 μL,总反应体积20 μL。37 ℃作用1 h后，95 ℃ 10 min灭活M MLV。
1.7 PCR反应
在20 μL的RT反应产物中，加入10×buffer10 μL，25 mmol/L氯化镁8 μL， 4×dNTP 1 μL，上游引物P1(50 pmol/L)0.5 μL，液体石蜡100 μL，95 ℃下5 min，然后加入TaqDNA聚合酶(106 U/L)2 μL。循环条件：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，35个循环;最后72 ℃延长7 min。
1.8 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳及其图像分析
PCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳20～30 min。紫外线灯下观察并拍照。用美国Kodak凝胶分析系统检测其吸光度(A)值作为表达强度，以β actin为内参照。表达强度=细胞因子A值/β actin A值。
1.9 Th1/Th2平衡状况的判断
如果仅IFN γ 和(或) IL 2表达，或者其表达强度比IL 10 和(或) IL 4的表达强度高，则为Th1状态;如果仅IL 10 和(或) IL 4表达，或者其表达强度比IFN γ 和(或) IL 2的表达强度高，则为Th2状态。如果4种细胞因子均未表达或表达强度一致或类似，则为Th0状态。
1.10 统计学处理
采用PPMS 1.5 统计软件[2]进行统计处理。
2 结 果
重组人生长激素组病人与单纯手术切除组术前Th1、Th2表达差异均无显著性(P>0.05)。两组术后第10天比较，差异有显著性(Uc=2.58，P<0.01)。见表2。
表2 两组不同时间Th1、Th2状况比较(例)组 别标本采取时间nTh1Th2Th0单纯手术切除组术前201424术后10 d20947重组人生长激素组术前161024术后10 d161411
3 讨 论
生长激素对儿童免疫功能有重要的调节作用。陈耀勇等以NK细胞、IL 1α和IL 2活性等指标，对去垂体大鼠及生长激素缺乏症(GHD)病儿在生长激素治疗前后的免疫指标进行了研究，发现去垂体大鼠NK细胞活性及IL 1α和IL 2活性均明显降低，外源性生长激素可使上述指标得到不同程度的恢复。GHD病儿NK细胞活性明显降低，经生长激素治疗3个月后恢复到正常水平， IL 1α和IL 2活性治疗后有逐渐增高的趋势。国内杨毅等研究则显示，儿童胸腺、 淋巴结和外周血淋巴细胞都有生长激素合成细胞，认为生长激素对于影响和调节小儿免疫系统发育具有重要作用。 生长激素对成年人免疫系统的调节也具有重要作用。正常人的胸腺和淋巴细胞上存在生长激素的结合位点，生长激素与之结合后可促进淋巴组织增生。研究显示，生长激素能影响T细胞的功能，并促使T细胞在胸腺中发育[3]。无论外源性或内源性生长激素均可使PHA激活的淋巴细胞IL 2R、 IL 2和IFN γ的表达增强，抗生长激素抗体可抵消这一作用，说明生长激素对淋巴细胞的功能具有重要的调节作用[4]。重组人生长激素可使危重病病人NK细胞活性增强，并提高CD4/CD8比率。由以上研究报道可以看出，重组人生长激素可增强机体的细胞免疫功能，NK细胞是Th1类细胞，IL 2和IFN γ是Th1类细胞因子，因此，重组人生长激素可能促使机体向Th1状态偏移。
以前的研究都未明确生长激素抗肿瘤作用的机制。自辅助性T细胞Th1/Th2亚群概念提出以来，人们对其在机体免疫反应中的作用进行了大量的研究[5]。正常机体的Th1/Th2类细胞因子处于动态平衡，当这个平衡失衡并向Th1状态或Th2状态转化时，称为Th1/Th2的偏移。病理状态下，如外伤、手术、感染和肿瘤等，均存在向Th2状态的偏移， Th2类细胞因子优势状态不利于创伤恢复和抗肿瘤免疫。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要方式。IFN γ、 IL 2和TNF β等细胞因子在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用，IL 2可刺激NK细胞和CTL细胞的杀瘤活性，而IFN γ有较强的抗肿瘤和免疫调节作用，TNF β可直接造成肿瘤细胞凋亡。以上细胞因子由Th1类细胞直接分泌，因此机体要处于良好的抗肿瘤状态，Th1类细胞应占优势。本实验结果表明，术后10 d重组人生长激素组比单纯手术切除组Th1类细胞因子表达明显增高，差异有显著性。这说明肝癌病人肿瘤切除后重组人生长激素应用5 d后可促使Th1类细胞因子表达，使Th1/Th2偏向Th1状态，有利于肿瘤的治疗。
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研究显示，生长激素对人体免疫系统发育及调节具有重要作用,生长激素可增强机体的细胞免疫功能,促使NK细胞活性增强，使白细胞介素2(IL 2)和干扰素(IFN γ)表达增强[1]。NK细胞是Th1类细胞，IL 2和IFN γ是Th1类细胞因子，因此推测重组人生长激素可能促使机体免疫状态向Th1状态偏移。本研究以IL 2和IFN γ代表Th1类细胞因子，白细胞介素4(IL 4)和白细胞介素10(IL 10)代表Th2类细胞因子，通过逆转录聚合酶链反应(RT PCR)技术检测原发性肝癌术后短期应用重组人生长激素后外周血单个核细胞(PBMC)Th1/Th2细胞因子的表达，探讨短期应用重组人生长激素在肝癌切除后对机体Th1/Th2偏移的影响，现将结果报告如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
原发性肝癌病人36例，分为重组人生长激素组和单纯手术切除组。重组人生长激素组16例，男14例，女2例;年龄38～66岁，平均52.5岁;肝细胞性肝癌10例，胆管细胞性肝癌3例，混合细胞性肝癌3例;肿瘤直径4.4～8.2 cm; HBcAb(+)10例，HBsAg(+)10例，HBsAb(+)4例，HBeAg(+)1例，HBeAb(+)4例。单纯手术切除组20例，男16例，女4例;年龄39～61岁，平均49.8岁;肝细胞性肝癌18例，胆管细胞性肝癌2例;肿瘤直径3.3～10.3 cm;HBsAg(+)18例，HBsAb(+)2例，HBeAg(+)2例，HBeAb(+)10例，HBcAb(+)18例。
1.2 标本来源
所有病人均于术前和术后10 d采集肘静脉血4 mL,EDTAK2抗凝。
1.3 PBMC的提取
用淋巴细胞分离液离心分层法分离提取病人血标本中的PBMC。
1.4 PBMC总RNA的提取
异硫氰酸胍法提取PBMC中的总RNA。
1.5 聚合酶链反应(PCR)引物
4种细胞因子和β actin的引物序列见表1。均由上海博亚生物工程公司合成。
1.6 逆转录反应
M MLV逆转录酶购自美国GB CO公司。 5～10 μg总RNA加入5×buffer 4 μL，0.1 mol/L DDT 2 μL, M MLV 1 μL(200U), 4×dNTP(10 mmol/L,每种)1 μL，下游引物P2 (50 pmol/L)0.5 μL,总反应体积20 μL。37 ℃作用1 h后，95 ℃ 10 min灭活M MLV。
1.7 PCR反应
在20 μL的RT反应产物中，加入10×buffer10 μL，25 mmol/L氯化镁8 μL， 4×dNTP 1 μL，上游引物P1(50 pmol/L)0.5 μL，液体石蜡100 μL，95 ℃下5 min，然后加入TaqDNA聚合酶(106 U/L)2 μL。循环条件：94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，35个循环;最后72 ℃延长7 min。
1.8 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳及其图像分析
PCR产物在15 g/L的琼脂糖凝胶上电泳20～30 min。紫外线灯下观察并拍照。用美国Kodak凝胶分析系统检测其吸光度(A)值作为表达强度，以β actin为内参照。表达强度=细胞因子A值/β actin A值。
1.9 Th1/Th2平衡状况的判断
如果仅IFN γ 和(或) IL 2表达，或者其表达强度比IL 10 和(或) IL 4的表达强度高，则为Th1状态;如果仅IL 10 和(或) IL 4表达，或者其表达强度比IFN γ 和(或) IL 2的表达强度高，则为Th2状态。如果4种细胞因子均未表达或表达强度一致或类似，则为Th0状态。
1.10 统计学处理
采用PPMS 1.5 统计软件[2]进行统计处理。
2 结 果
重组人生长激素组病人与单纯手术切除组术前Th1、Th2表达差异均无显著性(P>0.05)。两组术后第10天比较，差异有显著性(Uc=2.58，P<0.01)。见表2。
表2 两组不同时间Th1、Th2状况比较(例)组 别标本采取时间nTh1Th2Th0单纯手术切除组术前201424术后10 d20947重组人生长激素组术前161024术后10 d161411
3 讨 论
生长激素对儿童免疫功能有重要的调节作用。陈耀勇等以NK细胞、IL 1α和IL 2活性等指标，对去垂体大鼠及生长激素缺乏症(GHD)病儿在生长激素治疗前后的免疫指标进行了研究，发现去垂体大鼠NK细胞活性及IL 1α和IL 2活性均明显降低，外源性生长激素可使上述指标得到不同程度的恢复。GHD病儿NK细胞活性明显降低，经生长激素治疗3个月后恢复到正常水平， IL 1α和IL 2活性治疗后有逐渐增高的趋势。国内杨毅等研究则显示，儿童胸腺、 淋巴结和外周血淋巴细胞都有生长激素合成细胞，认为生长激素对于影响和调节小儿免疫系统发育具有重要作用。 生长激素对成年人免疫系统的调节也具有重要作用。正常人的胸腺和淋巴细胞上存在生长激素的结合位点，生长激素与之结合后可促进淋巴组织增生。研究显示，生长激素能影响T细胞的功能，并促使T细胞在胸腺中发育[3]。无论外源性或内源性生长激素均可使PHA激活的淋巴细胞IL 2R、 IL 2和IFN γ的表达增强，抗生长激素抗体可抵消这一作用，说明生长激素对淋巴细胞的功能具有重要的调节作用[4]。重组人生长激素可使危重病病人NK细胞活性增强，并提高CD4/CD8比率。由以上研究报道可以看出，重组人生长激素可增强机体的细胞免疫功能，NK细胞是Th1类细胞，IL 2和IFN γ是Th1类细胞因子，因此，重组人生长激素可能促使机体向Th1状态偏移。
以前的研究都未明确生长激素抗肿瘤作用的机制。自辅助性T细胞Th1/Th2亚群概念提出以来，人们对其在机体免疫反应中的作用进行了大量的研究[5]。正常机体的Th1/Th2类细胞因子处于动态平衡，当这个平衡失衡并向Th1状态或Th2状态转化时，称为Th1/Th2的偏移。病理状态下，如外伤、手术、感染和肿瘤等，均存在向Th2状态的偏移， Th2类细胞因子优势状态不利于创伤恢复和抗肿瘤免疫。细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要方式。IFN γ、 IL 2和TNF β等细胞因子在机体的抗肿瘤免疫中发挥重要作用，IL 2可刺激NK细胞和CTL细胞的杀瘤活性，而IFN γ有较强的抗肿瘤和免疫调节作用，TNF β可直接造成肿瘤细胞凋亡。以上细胞因子由Th1类细胞直接分泌，因此机体要处于良好的抗肿瘤状态，Th1类细胞应占优势。本实验结果表明，术后10 d重组人生长激素组比单纯手术切除组Th1类细胞因子表达明显增高，差异有显著性。这说明肝癌病人肿瘤切除后重组人生长激素应用5 d后可促使Th1类细胞因子表达，使Th1/Th2偏向Th1状态，有利于肿瘤的治疗。
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