探讨缬沙坦抗肾间质纤维化的作用机制 医药论文范文
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肾间质纤维化是各种原因导致的进行性肾脏疾病最重要的病理特点之一，是慢性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路[1,2]。而其中细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致ECM在肾间质的广泛沉积是肾间质纤维化发生的本质[2]。肾间质纤维化的促进因素涉及范围较广, 转化生长因子 β1 (TGF β1)是目前公认的强致纤维化因子[4]。骨桥蛋白(OPN)存在于多种生物中，可以多种不同的成熟形式存在于不同的组织细胞及正常体液中，具有多种生物学效应，可以引起大量炎性细胞浸润，而炎性细胞可产生TGF β1，参与间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞ECM的过量合成,最终导致肾间质纤维化的发生。本实验选用TGF β1、OPN作为观察指标，探讨缬沙坦抗肾间质纤维化的作用机制，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立与分组
50只雄性Wistar大鼠(青岛药检所动物中心提供)，体质量180～200 g，饲养于温控和光控动物室，适应性喂养1周后，随机分为对照组(12只)和实验组(38只)。实验组大鼠切开腹腔并游离左侧输尿管，用4 0线结扎左肾下极水平及左输尿管入膀胱处，然后在两结扎点间剪断输尿管，逐层缝合腹壁，建立UUO模型;对照组仅切开腹腔并游离左侧输尿管但不结扎和剪断。实验组共有36只大鼠造模成功，其中2只因手术失血死亡，36只大鼠随机分为模型组18只、缬沙坦组18只。缬沙坦组于术后第1天开始给予缬沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，直至大鼠处死前;对照组及模型组灌等量生理盐水。术后第3、10、20天对照组各处死4只大鼠，其余两组各处死6只大鼠。取左侧部分肾组织用40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋;其余肾组织快速液氮冷冻，-80 ℃保存。
1.2 观察指标及方法
1.2.1 生化指标的测定 处死大鼠前腹主动脉穿刺取血，采用美国LAND MARK公司生产全自动生化仪(型号AG Ⅱ)分别测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。
1.2.2 肾脏组织病理学观察 石蜡包埋组织切片，片厚2 μm，行常规苏木精 伊红染色，在200倍光镜下观察肾小管间质病变情况。
1.2.3 OPN检测 采用EliVision法，抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物工程有限公司，切片厚度2 μm，一抗为兔抗大鼠多克隆抗体(1∶100)，二抗为羊抗兔IgG(1∶100),DAB显色，并以0.01 mmol/L PBS缓冲液作为空白对照。采用Image Pro Plus病理图像分析软件，每张切片随机采集10个视野，检测阳性目标累积吸光度、空白区域面积，计算切片平均吸光度，用其反映OPN的表达强度。
1.2.4 TGF β1 mRNA表达检测 采用RT PCR方法，以Simply P 总RNA提取试剂盒(杭州博日生物科技有限公司)提取总RNA,严格按照其说明书操作。在核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf)上测定总RNA的吸光度(A)值并计算其浓度。RT及PCR操作步骤按照试剂盒说明书进行(日本TAK ARA公司)。TGF β1 引物：正义链5′ GCCTGAG TGGCTGTCTTTTGA 3′,反义链 5′ GGAAGGG TCGGTTCATGTCAT 3′,扩增产物长度为197 bp。GAPDH引物：正义链5′ GCAAAGTGGAGATTG TTGCCAT 3′,反义链 5′ CCTTGACTGTGCCGT TGAATTT 3′,扩增产物长度为108 bp。TGF β1的扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共32个循环;GAPDH的扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环;最后均72 ℃终末延伸10 min。取上述扩增产物5 μL在含溴化乙锭(0.5 mg/L)的20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线透射 凝胶成像仪(法国Vilber Lourmat 公司)检查有无特异条带并扫描各电泳带的灰度值，用美国Bio Rad公司的Mole cular Analyst软件进行半定量分析，计算其与内参照GAPDH吸光度比值。
1.3 统计学处理
以SPSS 10.0统计软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验。均数的多组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠术后不同时间生化指标的比较
与对照组比较，模型组及缬沙坦组大鼠术后第3天Scr及BUN差异无显著性(P>0.05)，第10、20天时显著增高,差异有统计学意义(F=11.75～40.83，q=3.32～11.87,P<0.05)。与模型组相比，缬沙坦组Scr及BUN术后第10、20天均较低，差异有显著性(q=3.36～9.55，P<0.05、0.01)。见表1、2。
2.2 术后大鼠肾脏组织病理学的改变
光镜下观察，术后第3天，模型组大鼠肾小管上皮细胞呈灶状空泡和颗粒变性，肾间质偶见灶状淋巴和单核细胞浸润，肾小管上皮细胞除变性外，部分出现崩解脱落及再生，部分呈灶状上皮细胞萎缩，管腔扩张，萎缩小管周围出现纤维化，伴少量淋巴和单核细胞浸润;第20天后肾间质纤维化及肾小管萎缩加重，呈多灶分布。肾小球始终无明显变化。各时间点治疗组与模型组相比，未见明显形态学差异。对照组大鼠肾脏无形态学异常。
2.3 各组大鼠术后不同时间肾组织OPN表达的比较
对照组肾组织中OPN主要表达于部分肾小管近曲小管、远曲小管、髓袢升支粗段及一些集合管上，肾间质未见着色;与对照组相比，模型组及缬沙坦组大鼠自第3天起OPN在肾小管间质的阳性染色强度明显升高， 差异有显著意义(F=64.36～231.51，q=14.17～30.42,P<0.01);与模型组比较，缬沙坦组大鼠从第10天起在肾小管间质的阳性染色强度明显降低，差异有显著性(q=5.85、14.30，P<0.01)。
3 讨 论
肾小管间质纤维化是慢性肾衰竭的重要病理表现，其与慢性肾衰竭的关系越来越受到重视。TGF β1具有促进成纤维细胞和肾小管上皮细胞表型转化及促进ECM合成的作用[6],并且还能通过减少基质降解酶(主要为基质金属蛋白酶，即MMPs)生成及增加基质降解酶抑制物(如TIMPs等)合成而抑制ECM降解，导致肾间质ECM(包括Col Ⅰ)蓄积[7,8]。另外，已经证实巨噬细胞与肾脏固有细胞及ECM相互作用导致组织损害，可以促进肾间质纤维化。近年大量的研究均提示，肾间质巨噬细胞积聚的程度与相应部位的纤维化程度呈正相关，原因为肾间质积聚的巨噬细胞可以产生包括TGF β1在内的一系列促纤维化因子，活化间质纤维母细胞产生细胞外基质而导致间质纤维化。有研究表明，趋化因子OPN表达上调是引起间质巨噬细胞积聚的直接原因，OPN可以介导巨噬细胞的黏附和迁移[9]。OPN 对T 细胞也具有趋化、激活作用,并能促进T 细胞的增殖,抗 OPN 中和抗体能显著抑制T 细胞聚集、活化。因此,OPN 既是一种趋化因子也是一种激活因子。肾脏损伤之后,肾小管细胞中OPN 的表达和管周局部的巨噬细胞浸润密切相关。有研究表明，体内OPN的高表达常与疾病活动相关[10]。LAMEIRE 等[11]研究显示，抗OPN 抗体能够有效地对抗巨噬细胞诱导大鼠新月体肾炎的发生。
肾素血管紧张素系统(RAS)的激活在肾脏病进展和恶化中起主要作用，阻断RAS可以保护肾功能。有研究结果显示，AngⅡ的致生长作用是通过自分泌或旁分泌TGF β1实现的[12]。AngⅡ能刺激TGF β1增加,其机制是AngⅡ通过血管紧张素Ⅱ受体1(AT1)提高TGF β1的mRNA水平,促使无活性的TGF β1向其活性形式转化[13]，TGF β1活化或活性升高是肾脏纤维化过程中的最终的共同调节因子。同时，AngⅡ也是巨噬细胞直接趋化因子，使血管内皮细胞和近端肾小管上皮细胞黏附因子表达增加，诱导单核细胞趋化蛋白 1和OPN原位表达。随着OPN表达量的增加，OPN又可以诱导单核巨噬细胞等炎细胞浸润，分泌TGF β1等生长因子;另外，巨噬细胞也能合成RAS成分，进而促进OPN的表达和巨噬细胞的浸润; TGF β1又可以进一步活化NF κB 而调控炎症因子的表达,促使OPN、MCP 1等过度表达，从而形成正反馈恶性循环。在UUO模型中，肾组织中有大量的AngⅡ，其主要受体AT1R的表达亦明显增多。阻断TGF β1信号或用ACEI 类药物均可阻断上述炎症过程[14]。另有研究显示，每天给大鼠注射牛血清清蛋白诱导制成蛋白尿模型后,肾间质可发生炎症及纤维化,并且在第4天时可见肾皮质中OPN mRNA 的表达显著升高,而1 周以后TGF β及巨噬细胞的表达才升高，可见OPN 在早期病变中即起到重要作用。
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肾间质纤维化是各种原因导致的进行性肾脏疾病最重要的病理特点之一，是慢性肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路[1,2]。而其中细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致ECM在肾间质的广泛沉积是肾间质纤维化发生的本质[2]。肾间质纤维化的促进因素涉及范围较广, 转化生长因子 β1 (TGF β1)是目前公认的强致纤维化因子[4]。骨桥蛋白(OPN)存在于多种生物中，可以多种不同的成熟形式存在于不同的组织细胞及正常体液中，具有多种生物学效应，可以引起大量炎性细胞浸润，而炎性细胞可产生TGF β1，参与间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞ECM的过量合成,最终导致肾间质纤维化的发生。本实验选用TGF β1、OPN作为观察指标，探讨缬沙坦抗肾间质纤维化的作用机制，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物模型的建立与分组
50只雄性Wistar大鼠(青岛药检所动物中心提供)，体质量180～200 g，饲养于温控和光控动物室，适应性喂养1周后，随机分为对照组(12只)和实验组(38只)。实验组大鼠切开腹腔并游离左侧输尿管，用4 0线结扎左肾下极水平及左输尿管入膀胱处，然后在两结扎点间剪断输尿管，逐层缝合腹壁，建立UUO模型;对照组仅切开腹腔并游离左侧输尿管但不结扎和剪断。实验组共有36只大鼠造模成功，其中2只因手术失血死亡，36只大鼠随机分为模型组18只、缬沙坦组18只。缬沙坦组于术后第1天开始给予缬沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，直至大鼠处死前;对照组及模型组灌等量生理盐水。术后第3、10、20天对照组各处死4只大鼠，其余两组各处死6只大鼠。取左侧部分肾组织用40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋;其余肾组织快速液氮冷冻，-80 ℃保存。
1.2 观察指标及方法
1.2.1 生化指标的测定 处死大鼠前腹主动脉穿刺取血，采用美国LAND MARK公司生产全自动生化仪(型号AG Ⅱ)分别测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。
1.2.2 肾脏组织病理学观察 石蜡包埋组织切片，片厚2 μm，行常规苏木精 伊红染色，在200倍光镜下观察肾小管间质病变情况。
1.2.3 OPN检测 采用EliVision法，抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物工程有限公司，切片厚度2 μm，一抗为兔抗大鼠多克隆抗体(1∶100)，二抗为羊抗兔IgG(1∶100),DAB显色，并以0.01 mmol/L PBS缓冲液作为空白对照。采用Image Pro Plus病理图像分析软件，每张切片随机采集10个视野，检测阳性目标累积吸光度、空白区域面积，计算切片平均吸光度，用其反映OPN的表达强度。
1.2.4 TGF β1 mRNA表达检测 采用RT PCR方法，以Simply P 总RNA提取试剂盒(杭州博日生物科技有限公司)提取总RNA,严格按照其说明书操作。在核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf)上测定总RNA的吸光度(A)值并计算其浓度。RT及PCR操作步骤按照试剂盒说明书进行(日本TAK ARA公司)。TGF β1 引物：正义链5′ GCCTGAG TGGCTGTCTTTTGA 3′,反义链 5′ GGAAGGG TCGGTTCATGTCAT 3′,扩增产物长度为197 bp。GAPDH引物：正义链5′ GCAAAGTGGAGATTG TTGCCAT 3′,反义链 5′ CCTTGACTGTGCCGT TGAATTT 3′,扩增产物长度为108 bp。TGF β1的扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共32个循环;GAPDH的扩增条件为：94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环;最后均72 ℃终末延伸10 min。取上述扩增产物5 μL在含溴化乙锭(0.5 mg/L)的20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线透射 凝胶成像仪(法国Vilber Lourmat 公司)检查有无特异条带并扫描各电泳带的灰度值，用美国Bio Rad公司的Mole cular Analyst软件进行半定量分析，计算其与内参照GAPDH吸光度比值。
1.3 统计学处理
以SPSS 10.0统计软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验。均数的多组间比较采用方差分析。
2 结 果
2.1 各组大鼠术后不同时间生化指标的比较
与对照组比较，模型组及缬沙坦组大鼠术后第3天Scr及BUN差异无显著性(P>0.05)，第10、20天时显著增高,差异有统计学意义(F=11.75～40.83，q=3.32～11.87,P<0.05)。与模型组相比，缬沙坦组Scr及BUN术后第10、20天均较低，差异有显著性(q=3.36～9.55，P<0.05、0.01)。见表1、2。
2.2 术后大鼠肾脏组织病理学的改变
光镜下观察，术后第3天，模型组大鼠肾小管上皮细胞呈灶状空泡和颗粒变性，肾间质偶见灶状淋巴和单核细胞浸润，肾小管上皮细胞除变性外，部分出现崩解脱落及再生，部分呈灶状上皮细胞萎缩，管腔扩张，萎缩小管周围出现纤维化，伴少量淋巴和单核细胞浸润;第20天后肾间质纤维化及肾小管萎缩加重，呈多灶分布。肾小球始终无明显变化。各时间点治疗组与模型组相比，未见明显形态学差异。对照组大鼠肾脏无形态学异常。
2.3 各组大鼠术后不同时间肾组织OPN表达的比较
对照组肾组织中OPN主要表达于部分肾小管近曲小管、远曲小管、髓袢升支粗段及一些集合管上，肾间质未见着色;与对照组相比，模型组及缬沙坦组大鼠自第3天起OPN在肾小管间质的阳性染色强度明显升高， 差异有显著意义(F=64.36～231.51，q=14.17～30.42,P<0.01);与模型组比较，缬沙坦组大鼠从第10天起在肾小管间质的阳性染色强度明显降低，差异有显著性(q=5.85、14.30，P<0.01)。
3 讨 论
肾小管间质纤维化是慢性肾衰竭的重要病理表现，其与慢性肾衰竭的关系越来越受到重视。TGF β1具有促进成纤维细胞和肾小管上皮细胞表型转化及促进ECM合成的作用[6],并且还能通过减少基质降解酶(主要为基质金属蛋白酶，即MMPs)生成及增加基质降解酶抑制物(如TIMPs等)合成而抑制ECM降解，导致肾间质ECM(包括Col Ⅰ)蓄积[7,8]。另外，已经证实巨噬细胞与肾脏固有细胞及ECM相互作用导致组织损害，可以促进肾间质纤维化。近年大量的研究均提示，肾间质巨噬细胞积聚的程度与相应部位的纤维化程度呈正相关，原因为肾间质积聚的巨噬细胞可以产生包括TGF β1在内的一系列促纤维化因子，活化间质纤维母细胞产生细胞外基质而导致间质纤维化。有研究表明，趋化因子OPN表达上调是引起间质巨噬细胞积聚的直接原因，OPN可以介导巨噬细胞的黏附和迁移[9]。OPN 对T 细胞也具有趋化、激活作用,并能促进T 细胞的增殖,抗 OPN 中和抗体能显著抑制T 细胞聚集、活化。因此,OPN 既是一种趋化因子也是一种激活因子。肾脏损伤之后,肾小管细胞中OPN 的表达和管周局部的巨噬细胞浸润密切相关。有研究表明，体内OPN的高表达常与疾病活动相关[10]。LAMEIRE 等[11]研究显示，抗OPN 抗体能够有效地对抗巨噬细胞诱导大鼠新月体肾炎的发生。
肾素血管紧张素系统(RAS)的激活在肾脏病进展和恶化中起主要作用，阻断RAS可以保护肾功能。有研究结果显示，AngⅡ的致生长作用是通过自分泌或旁分泌TGF β1实现的[12]。AngⅡ能刺激TGF β1增加,其机制是AngⅡ通过血管紧张素Ⅱ受体1(AT1)提高TGF β1的mRNA水平,促使无活性的TGF β1向其活性形式转化[13]，TGF β1活化或活性升高是肾脏纤维化过程中的最终的共同调节因子。同时，AngⅡ也是巨噬细胞直接趋化因子，使血管内皮细胞和近端肾小管上皮细胞黏附因子表达增加，诱导单核细胞趋化蛋白 1和OPN原位表达。随着OPN表达量的增加，OPN又可以诱导单核巨噬细胞等炎细胞浸润，分泌TGF β1等生长因子;另外，巨噬细胞也能合成RAS成分，进而促进OPN的表达和巨噬细胞的浸润; TGF β1又可以进一步活化NF κB 而调控炎症因子的表达,促使OPN、MCP 1等过度表达，从而形成正反馈恶性循环。在UUO模型中，肾组织中有大量的AngⅡ，其主要受体AT1R的表达亦明显增多。阻断TGF β1信号或用ACEI 类药物均可阻断上述炎症过程[14]。另有研究显示，每天给大鼠注射牛血清清蛋白诱导制成蛋白尿模型后,肾间质可发生炎症及纤维化,并且在第4天时可见肾皮质中OPN mRNA 的表达显著升高,而1 周以后TGF β及巨噬细胞的表达才升高，可见OPN 在早期病变中即起到重要作用。
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