HPLC法检测红景天苷和酪醇含量-医学论文的书写格式
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1 材料
红景天购于成都五块石药材市场，经四川大学生命科学学院许介眉教授鉴定系景天科（Crassulaceae）红景天属Rhodiola crenulata Hook.f.et Thoms。菌种：本实验室保存，除2号为米曲霉外，其余菌株均为黑曲霉。 培养基：红景天发酵培养基：红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基：麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基：麸皮∶水=1∶5，煮沸20 min，过滤，取滤液，加MgSO4 0.05%， KH2PO5 0.1%，（NH4）2SO4 0.1%。试剂：酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。
2 方法
2.1 培养方法
2.1.1 孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基，30℃培养48 h，加水洗下孢子，稀释至孢子浓度约108个/ml。
2.1.2 菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基，30℃，200 r/min，时间48 h。
2.1.3 红景天发酵培养30℃，200 r/min，时间为2～4 d。
2.2 提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次，合并滤液，得到发酵提取液，用于重氮盐比色法测定和HPLC检测。
2.3 测定方法
2.3.1 重氮盐比色法［6］取发酵提取液5 ml，加入10%的醋酸铅5 ml和饱和硫酸钠2 ml，定容至25 ml，沉淀、离心，取上清液5 ml于20 ml比色管中，其中加2%碳酸钠3 ml及重氮化试剂3 ml，摇匀显色5 min，再加5%氢氧化钠0.5 ml，显色15 min，整个过程在4℃以下进行，稀释10倍，在489 nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分（苷和酪醇的总量）的初筛指标。
2.3.2 HPLC检测［7］色谱条件：岛津LC-6A 高效液相色谱仪；色谱柱为YWM-C18（10u）200 nm×4.6 mm；流动相为V（甲醇）：V（高水）=25∶75 ；检测波长275 nm；自然pH；柱温为室温；进样量：20 μl；流速1.0 ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00 mg，分别置于25 ml的容量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成浓度为1.00 mg·ml-1的标准品，取苷标准品溶液进样2，4，6，8，10，12 μl，酪醇标准品溶液进样1，2，3，4，5，6 μl，测定峰面积，以峰面积（Y）与对照液中红景天苷和酪醇的质量（X/μg）作回归计算，得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件进行。
3 结果
3.1 双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中，已对重氮盐比色法和HPLC进行对比测定，证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果，与HPLC测定值有较好的相关性（另文发表）。从已分离到的微生物中，选出发酵能力较高的8株霉菌，两两组合，接种于红景天发酵培养基中进行混合菌株发酵，并与单菌株发酵比较。由表1及图1可以看出，22种双菌株组合中，83.33%的高于对照，22.72%高于单菌株发酵，其中有4对组合高于对照170%以上（高于单菌株发酵29.27%以上）。
3.2 双菌株复筛以峰面积（Y）与对照液中红景天苷的量（X/μg）作回归计算，结果表明红景天苷含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y= 7 684 080.042 9X+ 64 169.261 9，r=0.999 7（n=6）；以峰面积（Y）与对照液中酪醇的量（X/μg）作回归计算，结果表明酪醇含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1 180 000X-7 624.23，r=0.999 8（n=6）。将初筛中有效成分最高的7个双菌株组合，接种于红景天发酵培养基中发酵，用HPLC测定其中红景天苷和酪醇的含量，算出百分含量。由表2可以看出，在单菌株发酵中，红景天苷和酪醇分别以35号和49号菌株最高；双菌组合发酵后，酪醇含量均低于49号单菌株，但35-42菌株组合发酵后红景天苷和总有效成分含量，均明显高于所有单菌和其余双菌株发酵。35-42组合发酵后红景天苷、酪醇和总有效成分分别比原药材提高44.36%，26.83%和39.74%，均高于所组合的单一菌株35号和42号。主要发酵条件的优化以35-42为组合菌株，通过正交实验对红景天主要发酵条件进行优化，用重氮盐比色法测定红景天总有效成分的含量。
3.3 双菌株接种比例的确定以正交实验所得最佳条件为基础，将 35号和42号菌株以不同比例混合接种发酵红景天，通过HPLC来检测红景天苷和酪醇含量，求得百分含量。由表5可得，35-42双菌株混菌比例为2∶8时红景天苷和总有效成分最高，这是由于混菌发酵利用不同菌株作用效果的差异，适宜的接种比例可以使代谢协调，从而提高产率。
3.4 35-42双菌株组合的发酵曲线和发酵时间的确定以HPLC测定35-42双菌株发酵不同阶段红景天苷和酪醇的含量。结果见图2。由图2可以看出，双菌株组合接种6 h后红景天苷逐渐增加，在60 h达到最大值，此后逐步降低。酪醇含量在0～54 h内变化不大，但在红景天苷接近峰值时，开始下降，总有效成分在54 h达到最大值，此后，随着酪醇的下降而降低。由于红景天质量检验是以苷的含量为准，因此将发酵时间确定为60 h。经初步测算，双菌株发酵使红景天原药材中红景天苷提高86.29%，已大大超过盈亏平衡点，具有很强的应用前景。后续需要在菌种选育、发酵机理、药效和中试工艺条件进行研究。
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1 材料
红景天购于成都五块石药材市场，经四川大学生命科学学院许介眉教授鉴定系景天科（Crassulaceae）红景天属Rhodiola crenulata Hook.f.et Thoms。菌种：本实验室保存，除2号为米曲霉外，其余菌株均为黑曲霉。 培养基：红景天发酵培养基：红景天粉与水以1∶10的比例。固体种子培养基：麸皮∶水=1∶1。液体种子培养基：麸皮∶水=1∶5，煮沸20 min，过滤，取滤液，加MgSO4 0.05%， KH2PO5 0.1%，（NH4）2SO4 0.1%。试剂：酪醇标准品、红景天苷标准品均购于成都思科华有限责任公司，甲醇为一级色谱纯。
2 方法
2.1 培养方法
2.1.1 孢子悬液制备将菌株接种于固体种子培养基，30℃培养48 h，加水洗下孢子，稀释至孢子浓度约108个/ml。
2.1.2 菌丝体制备按0.1%接种量将孢子悬液接入液体种子培养基，30℃，200 r/min，时间48 h。
2.1.3 红景天发酵培养30℃，200 r/min，时间为2～4 d。
2.2 提取方法红景天发酵液用75%的乙醇按照1∶8的比例分别提取3次，合并滤液，得到发酵提取液，用于重氮盐比色法测定和HPLC检测。
2.3 测定方法
2.3.1 重氮盐比色法［6］取发酵提取液5 ml，加入10%的醋酸铅5 ml和饱和硫酸钠2 ml，定容至25 ml，沉淀、离心，取上清液5 ml于20 ml比色管中，其中加2%碳酸钠3 ml及重氮化试剂3 ml，摇匀显色5 min，再加5%氢氧化钠0.5 ml，显色15 min，整个过程在4℃以下进行，稀释10倍，在489 nm波长下测定吸光度。以吸光度高低作为总有效成分（苷和酪醇的总量）的初筛指标。
2.3.2 HPLC检测［7］色谱条件：岛津LC-6A 高效液相色谱仪；色谱柱为YWM-C18（10u）200 nm×4.6 mm；流动相为V（甲醇）：V（高水）=25∶75 ；检测波长275 nm；自然pH；柱温为室温；进样量：20 μl；流速1.0 ml·min-1。精密称取红景天苷、酪醇标准品25.00 mg，分别置于25 ml的容量瓶中，无水乙醇溶解定容，制成浓度为1.00 mg·ml-1的标准品，取苷标准品溶液进样2，4，6，8，10，12 μl，酪醇标准品溶液进样1，2，3，4，5，6 μl，测定峰面积，以峰面积（Y）与对照液中红景天苷和酪醇的质量（X/μg）作回归计算，得到标准曲线。发酵产物中红景天苷和酪醇的含量测定按以上条件进行。
3 结果
3.1 双菌株初筛在本研究前期的菌株筛选工作中，已对重氮盐比色法和HPLC进行对比测定，证明重氮盐比色法测定红景天总有效成分的结果，与HPLC测定值有较好的相关性（另文发表）。从已分离到的微生物中，选出发酵能力较高的8株霉菌，两两组合，接种于红景天发酵培养基中进行混合菌株发酵，并与单菌株发酵比较。由表1及图1可以看出，22种双菌株组合中，83.33%的高于对照，22.72%高于单菌株发酵，其中有4对组合高于对照170%以上（高于单菌株发酵29.27%以上）。
3.2 双菌株复筛以峰面积（Y）与对照液中红景天苷的量（X/μg）作回归计算，结果表明红景天苷含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y= 7 684 080.042 9X+ 64 169.261 9，r=0.999 7（n=6）；以峰面积（Y）与对照液中酪醇的量（X/μg）作回归计算，结果表明酪醇含量在2.00～12.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为：Y=1 180 000X-7 624.23，r=0.999 8（n=6）。将初筛中有效成分最高的7个双菌株组合，接种于红景天发酵培养基中发酵，用HPLC测定其中红景天苷和酪醇的含量，算出百分含量。由表2可以看出，在单菌株发酵中，红景天苷和酪醇分别以35号和49号菌株最高；双菌组合发酵后，酪醇含量均低于49号单菌株，但35-42菌株组合发酵后红景天苷和总有效成分含量，均明显高于所有单菌和其余双菌株发酵。35-42组合发酵后红景天苷、酪醇和总有效成分分别比原药材提高44.36%，26.83%和39.74%，均高于所组合的单一菌株35号和42号。主要发酵条件的优化以35-42为组合菌株，通过正交实验对红景天主要发酵条件进行优化，用重氮盐比色法测定红景天总有效成分的含量。
3.3 双菌株接种比例的确定以正交实验所得最佳条件为基础，将 35号和42号菌株以不同比例混合接种发酵红景天，通过HPLC来检测红景天苷和酪醇含量，求得百分含量。由表5可得，35-42双菌株混菌比例为2∶8时红景天苷和总有效成分最高，这是由于混菌发酵利用不同菌株作用效果的差异，适宜的接种比例可以使代谢协调，从而提高产率。
3.4 35-42双菌株组合的发酵曲线和发酵时间的确定以HPLC测定35-42双菌株发酵不同阶段红景天苷和酪醇的含量。结果见图2。由图2可以看出，双菌株组合接种6 h后红景天苷逐渐增加，在60 h达到最大值，此后逐步降低。酪醇含量在0～54 h内变化不大，但在红景天苷接近峰值时，开始下降，总有效成分在54 h达到最大值，此后，随着酪醇的下降而降低。由于红景天质量检验是以苷的含量为准，因此将发酵时间确定为60 h。经初步测算，双菌株发酵使红景天原药材中红景天苷提高86.29%，已大大超过盈亏平衡点，具有很强的应用前景。后续需要在菌种选育、发酵机理、药效和中试工艺条件进行研究。
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