隐丹参酮对类风湿关节炎的抑制作用研究-护士大专毕业论文
护士大专毕业论文 护士本科毕业论文 医学护理类论文 护理类论文发表
1 材料与仪器
1.1 动物雄性Sprague Dawley （SD）大鼠，体质量（160±20）g，安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准第01号。
1.2 药物与试剂隐丹参酮（CT），批号：050428，由中山大学药学院提供；卡介苗，每支50mg，上海生物制品所生产；鸡II型胶原（CII），上海本草生物医学研究所产品；DMEM培养粉，美国Gibco公司产品；刀豆蛋白A （concanavalin A， Con A） 、脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）：美国Sigma公司产品；二甲亚砜（DMSO，分析纯），天津市光复精细化工研究所产品；溴化 3（4，5 二甲基噻唑 2）2，5 二甲苯基四氮唑（四甲基偶氮唑蓝，MTT），美国Sigma公司产品。
1.3 仪器Napco 6100型CO2培养箱（美国杜邦公司产品）；GL 20A全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）；EL 301 strip reader（美国Bio TeK公司）。
2 方法
2.1 药物的配制CT先用无水乙醇溶解，再用无血清的DMEM培养液配制所需的5个浓度。刀豆素A（ConA），脂多糖（LPS）分别用无血清的DMEM培养液配制。
2.2 大鼠CIA模型的建立［1］将CⅡ溶于0.1 mol·L 1醋酸中，在4 ℃下搅拌使之充分溶解，质量浓度为2g·L-1，置4 ℃冰箱过夜，再将灭活的卡介苗置于液体石蜡中，配成0.5 g·L-1的完全弗氏佐剂，将二者等体积混合、乳化，制成CⅡ乳剂。将该乳剂于大鼠的右后足趾皮内注射0.1 ml致炎，第7天尾根部近1/3处和背部3～5点皮内注射该乳剂0.1 ml作为激发注射。
2.3 胸腺T淋巴细胞，脾脏B淋巴细胞增殖功能测定（MTT法）［2］分别取正常大鼠和致炎后35d CIA大鼠，无菌取胸腺和脾制成淋巴细胞悬液，调整细胞至终浓度为1×107/ml，DMEM培养液培养细胞，在96孔培养板上每孔加入100 μl细胞悬液，50μlConA（终浓度5μg/ml）或LPS（终浓度6 μg/ml），50 μl不同浓度的CT（0.1，1，10，100，1 000 μg/ml）培养48 h，终止培养前4h加入20 μl MTT （5mg/ml），继续培养4h后加入150 μlDMSO终止反应，酶标仪检测（490 nm）吸光度（absorbance， A）值，结果以3个复孔A值的均值表示。
3 结果
由表1可知， LPS诱导的脾脏B淋巴细胞和ConA刺激的胸腺T淋巴细胞增殖较正常对照显着增强，差别有显着意义（P<0.01）；而CT不同浓度对其增殖表现出不同的效应，低浓度时进一步促进其增殖，1μg/ml时对B、T淋巴细胞增殖反应的促进作用均有统计学意义（P<0.05）。随着浓度的增高，出现抑制作用，100，1 000 μg/ml剂量组对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，1 000 μg/ml剂量组对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，分别与刺激剂诱导的正常组比较，差异有显着意义（P<0.01）。由表2中可知，在CIA大鼠中LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖反应较正常对照显着增强；ConA诱导的胸腺T淋巴细胞增殖反应却较正常对照组明显降低，差别均有显着意义（P<0.01）；而CT不同浓度对其增殖表现出不同的效应，0.1μg/ml时对CIA大鼠低下的胸腺T淋巴细胞增殖具有明显的改善作用（P<0.05），而高浓度时（100，1 000 μg/ml）对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的抑制作用（P<0.01）。
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1.1 动物雄性Sprague Dawley （SD）大鼠，体质量（160±20）g，安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号：皖医实动准第01号。
1.2 药物与试剂隐丹参酮（CT），批号：050428，由中山大学药学院提供；卡介苗，每支50mg，上海生物制品所生产；鸡II型胶原（CII），上海本草生物医学研究所产品；DMEM培养粉，美国Gibco公司产品；刀豆蛋白A （concanavalin A， Con A） 、脂多糖（ lipopolysaccharide，LPS）：美国Sigma公司产品；二甲亚砜（DMSO，分析纯），天津市光复精细化工研究所产品；溴化 3（4，5 二甲基噻唑 2）2，5 二甲苯基四氮唑（四甲基偶氮唑蓝，MTT），美国Sigma公司产品。
1.3 仪器Napco 6100型CO2培养箱（美国杜邦公司产品）；GL 20A全自动高速冷冻离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）；EL 301 strip reader（美国Bio TeK公司）。
2 方法
2.1 药物的配制CT先用无水乙醇溶解，再用无血清的DMEM培养液配制所需的5个浓度。刀豆素A（ConA），脂多糖（LPS）分别用无血清的DMEM培养液配制。
2.2 大鼠CIA模型的建立［1］将CⅡ溶于0.1 mol·L 1醋酸中，在4 ℃下搅拌使之充分溶解，质量浓度为2g·L-1，置4 ℃冰箱过夜，再将灭活的卡介苗置于液体石蜡中，配成0.5 g·L-1的完全弗氏佐剂，将二者等体积混合、乳化，制成CⅡ乳剂。将该乳剂于大鼠的右后足趾皮内注射0.1 ml致炎，第7天尾根部近1/3处和背部3～5点皮内注射该乳剂0.1 ml作为激发注射。
2.3 胸腺T淋巴细胞，脾脏B淋巴细胞增殖功能测定（MTT法）［2］分别取正常大鼠和致炎后35d CIA大鼠，无菌取胸腺和脾制成淋巴细胞悬液，调整细胞至终浓度为1×107/ml，DMEM培养液培养细胞，在96孔培养板上每孔加入100 μl细胞悬液，50μlConA（终浓度5μg/ml）或LPS（终浓度6 μg/ml），50 μl不同浓度的CT（0.1，1，10，100，1 000 μg/ml）培养48 h，终止培养前4h加入20 μl MTT （5mg/ml），继续培养4h后加入150 μlDMSO终止反应，酶标仪检测（490 nm）吸光度（absorbance， A）值，结果以3个复孔A值的均值表示。
3 结果
由表1可知， LPS诱导的脾脏B淋巴细胞和ConA刺激的胸腺T淋巴细胞增殖较正常对照显着增强，差别有显着意义（P<0.01）；而CT不同浓度对其增殖表现出不同的效应，低浓度时进一步促进其增殖，1μg/ml时对B、T淋巴细胞增殖反应的促进作用均有统计学意义（P<0.05）。随着浓度的增高，出现抑制作用，100，1 000 μg/ml剂量组对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，1 000 μg/ml剂量组对ConA诱导的T淋巴细胞增殖有明显的抑制作用，分别与刺激剂诱导的正常组比较，差异有显着意义（P<0.01）。由表2中可知，在CIA大鼠中LPS诱导的脾脏B淋巴细胞增殖反应较正常对照显着增强；ConA诱导的胸腺T淋巴细胞增殖反应却较正常对照组明显降低，差别均有显着意义（P<0.01）；而CT不同浓度对其增殖表现出不同的效应，0.1μg/ml时对CIA大鼠低下的胸腺T淋巴细胞增殖具有明显的改善作用（P<0.05），而高浓度时（100，1 000 μg/ml）对LPS诱导的B淋巴细胞增殖有明显的抑制作用（P<0.01）。
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