川木通类药材药性成分检测实验-护理专科论文
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1 材料
本实验所使用的川木通原植物均为作者在四川各地实地采集，植物叶片采集后采用硅胶直接干燥，另外部分采集后直接编号用液氮保存，此后保存在-80℃冰箱备用，所采集植物均经过万德光教授鉴定后备用。Taq聚合酶、dNTP、T4连接酶、琼脂糖购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；RAPD引物购自北京赛百盛公司。
2 方法
2.1 植物总DNA的小规模提取与DNA浓度的测定提取方法按干滟等［3］的方法并稍加改进。测定浓度后稀释至50 ng/μl。
2.2 PCR反应因素水平的确定与正交表的设计［4］为了确定PCR反应中的5个因素（Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物）的最佳水平，采用正交设计L16（45）在4个水平上进行实验。参加PCR反应的因素水平见表1，L16（45）设计方案见表2。将表2的16个处理重复两次，在PCR仪上进行扩增，结果电泳检测，记录。用统计软件MINITAB进行分析，得到川木通RAPD-PCR反应各因素的最佳水平，最后在PCR仪上，用此最佳因素水平的PCR反应体系进行梯度退火试验，筛选得到最佳退火温度。
2.3 RAPD扩增在正交结果的基础上，建立了本实验所使用的体系［5，6］。RAPD扩增反应所采用的条件和体系如下：20 μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs， 1.0UTaq 酶，0.5 μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。电泳分析与结果统计DNA扩增产物在1×TAE的缓冲条件下，于1.5%琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色。标准分子量为Tokara提供的DL2000 Marker。使用凝胶成像系统（GDS8000，美国UVP）拍照分析。
3 结果
电泳结果评分按照表2设计的16个处理进行PCR反应后，产物进行电泳。根据电泳结果，按照本实验目的，即以后将要进行的遗传多样性分析的要求将16个处理从高到低依次打分，条带数量越丰富、清晰度越高、背景低的最佳产物记为16分，与此相反，最差的记为1分［7,8］。两次重复分别独立设计，从两次重复的结果看，各个处理组合的反应都具有较高的一致性。两次记分分别为1，13，14，11，10，16，15，12，2，9，8，7，6，5，4，3和1，12，14，13，10，16，11，15，2，8，9，7，5，6，4，3。
因素内各水平对PCR结果的影响为了分析各因素的最佳反应水平，在方差分析的基础上，继续对每个因素各个水平作多重比较，评价结果如下。Taq酶的0.1与0.2，0.3与0.4水平差异不显着，其余组合差异显着。由于Taq酶对结果影响最大，0.3与0.4水平达到了反应的最佳效果，且水平间差异不明显，从经济角度考虑选择了0.3水平为最佳反应水平。最终，RAPD-PCR反应的条件确定为：20μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq 酶，0.5 μmol/L 10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。
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1 材料
本实验所使用的川木通原植物均为作者在四川各地实地采集，植物叶片采集后采用硅胶直接干燥，另外部分采集后直接编号用液氮保存，此后保存在-80℃冰箱备用，所采集植物均经过万德光教授鉴定后备用。Taq聚合酶、dNTP、T4连接酶、琼脂糖购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；RAPD引物购自北京赛百盛公司。
2 方法
2.1 植物总DNA的小规模提取与DNA浓度的测定提取方法按干滟等［3］的方法并稍加改进。测定浓度后稀释至50 ng/μl。
2.2 PCR反应因素水平的确定与正交表的设计［4］为了确定PCR反应中的5个因素（Taq 酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物）的最佳水平，采用正交设计L16（45）在4个水平上进行实验。参加PCR反应的因素水平见表1，L16（45）设计方案见表2。将表2的16个处理重复两次，在PCR仪上进行扩增，结果电泳检测，记录。用统计软件MINITAB进行分析，得到川木通RAPD-PCR反应各因素的最佳水平，最后在PCR仪上，用此最佳因素水平的PCR反应体系进行梯度退火试验，筛选得到最佳退火温度。
2.3 RAPD扩增在正交结果的基础上，建立了本实验所使用的体系［5，6］。RAPD扩增反应所采用的条件和体系如下：20 μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs， 1.0UTaq 酶，0.5 μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。电泳分析与结果统计DNA扩增产物在1×TAE的缓冲条件下，于1.5%琼脂糖凝胶分离，溴化乙锭染色。标准分子量为Tokara提供的DL2000 Marker。使用凝胶成像系统（GDS8000，美国UVP）拍照分析。
3 结果
电泳结果评分按照表2设计的16个处理进行PCR反应后，产物进行电泳。根据电泳结果，按照本实验目的，即以后将要进行的遗传多样性分析的要求将16个处理从高到低依次打分，条带数量越丰富、清晰度越高、背景低的最佳产物记为16分，与此相反，最差的记为1分［7,8］。两次重复分别独立设计，从两次重复的结果看，各个处理组合的反应都具有较高的一致性。两次记分分别为1，13，14，11，10，16，15，12，2，9，8，7，6，5，4，3和1，12，14，13，10，16，11，15，2，8，9，7，5，6，4，3。
因素内各水平对PCR结果的影响为了分析各因素的最佳反应水平，在方差分析的基础上，继续对每个因素各个水平作多重比较，评价结果如下。Taq酶的0.1与0.2，0.3与0.4水平差异不显着，其余组合差异显着。由于Taq酶对结果影响最大，0.3与0.4水平达到了反应的最佳效果，且水平间差异不明显，从经济角度考虑选择了0.3水平为最佳反应水平。最终，RAPD-PCR反应的条件确定为：20μl体系，其中含1×PCR buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTPs，1.0 U Taq 酶，0.5 μmol/L 10-mer引物，50ng模板DNA，补ddH2O至终体积20 μl。PCR反应热循环程序如下：95℃预变性5 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min；94℃变性1 min；36℃复性1 min；72℃延伸1.5 min，35个循环。最后72℃延伸10 min，反应产物在4℃保存。
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