探讨沙利度胺对肝癌血管生成的作用 2012医学核心期刊目录
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沙利度胺是一种谷氨酸衍生物，最初用于治疗早孕反应和镇静催眠，后来因其有严重的致畸作用而被禁用。20世纪90年代，有学者发现沙利度胺具有抑制血管生成的作用而将其应用于髓系肿瘤的治疗，目前将其应用于实体瘤治疗的研究较少。本文测定了沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC 7721体外增殖的影响，探讨其对肝癌血管生成的作用，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物及试剂 RPMI 1640培养基，GIBCO公司生产。新生牛血清，中美合资兰州民海生物工程有限公司生产。胰蛋白酶，美国Sigma公司生产。VEGF ELISA试剂盒,购自晶美生物工程公司。沙利度胺，常州制药厂惠赠。
1.1.2 细胞株 人肝癌细胞株SMMC 7721购自中国医学科学院药物研究所药理室。
1.1.3 仪器 CO2培养箱(Forma 3110，USA)，超净工作台(BCN 1360，哈尔滨东联)，酶标仪(Bio TEK Synergy HT, USA)，倒置显微镜(Nikon TE 2000)，细胞培养瓶(Costar, USA)，96孔细胞培养板(Costar, USA)。
1.2 实验方法
1.2.1 药物及试剂配制 将RPMI 1640培养基500 mL加水1 L，补加2 g碳酸氢钠，10万单位青霉素和100 mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22 μm除菌滤膜过滤除菌。将9份经以上处理的培养基加灭活新生牛血清1份即为完全培养液。胰蛋白酶用D hanks缓冲液配成浓度为2.5 g/L的溶液，过滤除菌后-40 ℃保存备用。取沙利度胺加入DMSO配成120 g/L原液，取10 μL加入到1 mL完全培养液中，制成终浓度为1.2 g/L的待测样品溶液。
1.2.2 细胞培养及处理 肝癌细胞均贴壁培养于含5 mL完全培养液细胞培养瓶中，于37 ℃、含体
420青 岛 大 学 医 学 院 学 报45卷
积分数0.05 CO2、饱合湿度下培养。细胞长成完整单层时，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞数目(死细胞数目不得超过5%)，用完全培养液调整细胞密度为5×107/L，于96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，置于CO2培养箱中培养24 h。于每孔中补加不等体积完全培养液，再加不同体积的待测样品，使得药物的终浓度分别为3.125、6.250、 12.500、 25.000、 50.000、 100.000及200.000 mg/L，每组分别设4个复孔。空白对照组加入等体积RPMI 1640培养液。放入37 ℃培养箱继续培养。
1.2.3 细胞增殖抑制率的测定 采用MTT法。加药后2 d，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL,37 ℃继续培养4 h后，吸弃培养上清液，每孔加入200 μL DMSO，震荡10 min，使甲 充分溶解。在酶标仪上测定各孔490 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0分析软件进行数据处理,数据间比较采用完全随机设计的方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
本文结果表明，沙利度胺浓度从3.125 mg/L依次增至200.000 mg/L，其对SMMC 7721细胞增殖抑制率从11.70%依次增加至34.21%。沙利度胺25.000 mg/L以上浓度组的A值与空白对照组相比较，差异均有显著意义(F=3.093，q=4.02～5.37，P<0.05、0.01)。见表1。表1 不同浓度沙利度胺作用于SMMC 7721细胞的增殖抑制率比较
3 讨 论
原发性肝癌是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一，占世界癌症死亡原因的第3位，严重危害人类的健康。目前肝癌的治疗主要以手术切除为主，放疗、化疗、靶向治疗等方法效果不满意，这主要与肝癌侵袭转移的生物学特性有关。肝细胞癌是典型的多血管性肿瘤[1]，肝癌诱导新生血管生成的能力对于其生长、转移十分关键，因此寻找有效抑制血管生成的药物对于提高肝癌的疗效具有重要意义。
沙利度胺近年来作为血管生成抑制剂引起肿瘤学界关注，目前研究主要集中于其对血液系统肿瘤及部分实体瘤，包括骨髓瘤[2]、神经胶质瘤[3]、前列腺癌[4]、恶性黑色素瘤[5]等的作用，而有关沙利度胺治疗肝癌的研究报道较少。多项研究表明，其抗肿瘤机制可能与抑制肿瘤血管生成有关[6,7]。为探讨沙利度胺对肝癌细胞株SMMC 7721生长的影响，本文采用不同浓度的沙利度胺作用于SMMC 7721细胞株，应用MTT法测定吸光度值并计算细胞生长抑制率。结果显示，沙利度胺浓度从3.125 mg/L依次增至200.000 mg/L，其对肝癌细胞SMMC 7721的增殖抑制率从11.70%依次增至34.21%，当沙利度胺浓度达到25.0000 mg/L以上时，其对肝癌细胞株SMMC 7721的抑制作用与对照组比较差异有统计学意义。说明沙利度胺对体外SMMC 7721细胞株的增殖有抑制作用，且随着药物剂量的增加，细胞抑制作用逐渐增强。本文结果为沙利度胺的临床应用提供了依据。
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沙利度胺是一种谷氨酸衍生物，最初用于治疗早孕反应和镇静催眠，后来因其有严重的致畸作用而被禁用。20世纪90年代，有学者发现沙利度胺具有抑制血管生成的作用而将其应用于髓系肿瘤的治疗，目前将其应用于实体瘤治疗的研究较少。本文测定了沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC 7721体外增殖的影响，探讨其对肝癌血管生成的作用，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药物及试剂 RPMI 1640培养基，GIBCO公司生产。新生牛血清，中美合资兰州民海生物工程有限公司生产。胰蛋白酶，美国Sigma公司生产。VEGF ELISA试剂盒,购自晶美生物工程公司。沙利度胺，常州制药厂惠赠。
1.1.2 细胞株 人肝癌细胞株SMMC 7721购自中国医学科学院药物研究所药理室。
1.1.3 仪器 CO2培养箱(Forma 3110，USA)，超净工作台(BCN 1360，哈尔滨东联)，酶标仪(Bio TEK Synergy HT, USA)，倒置显微镜(Nikon TE 2000)，细胞培养瓶(Costar, USA)，96孔细胞培养板(Costar, USA)。
1.2 实验方法
1.2.1 药物及试剂配制 将RPMI 1640培养基500 mL加水1 L，补加2 g碳酸氢钠，10万单位青霉素和100 mg链霉素，调节pH值至7.4，用0.22 μm除菌滤膜过滤除菌。将9份经以上处理的培养基加灭活新生牛血清1份即为完全培养液。胰蛋白酶用D hanks缓冲液配成浓度为2.5 g/L的溶液，过滤除菌后-40 ℃保存备用。取沙利度胺加入DMSO配成120 g/L原液，取10 μL加入到1 mL完全培养液中，制成终浓度为1.2 g/L的待测样品溶液。
1.2.2 细胞培养及处理 肝癌细胞均贴壁培养于含5 mL完全培养液细胞培养瓶中，于37 ℃、含体
420青 岛 大 学 医 学 院 学 报45卷
积分数0.05 CO2、饱合湿度下培养。细胞长成完整单层时，胰蛋白酶消化后收集细胞，用移液管吹打均匀，取两滴细胞悬液台盼蓝染色，显微镜下计数活细胞数目(死细胞数目不得超过5%)，用完全培养液调整细胞密度为5×107/L，于96孔细胞培养板中每孔加入100 μL细胞悬液，置于CO2培养箱中培养24 h。于每孔中补加不等体积完全培养液，再加不同体积的待测样品，使得药物的终浓度分别为3.125、6.250、 12.500、 25.000、 50.000、 100.000及200.000 mg/L，每组分别设4个复孔。空白对照组加入等体积RPMI 1640培养液。放入37 ℃培养箱继续培养。
1.2.3 细胞增殖抑制率的测定 采用MTT法。加药后2 d，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL,37 ℃继续培养4 h后，吸弃培养上清液，每孔加入200 μL DMSO，震荡10 min，使甲 充分溶解。在酶标仪上测定各孔490 nm波长处吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。
1.3 统计学处理
采用SPSS 13.0分析软件进行数据处理,数据间比较采用完全随机设计的方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
本文结果表明，沙利度胺浓度从3.125 mg/L依次增至200.000 mg/L，其对SMMC 7721细胞增殖抑制率从11.70%依次增加至34.21%。沙利度胺25.000 mg/L以上浓度组的A值与空白对照组相比较，差异均有显著意义(F=3.093，q=4.02～5.37，P<0.05、0.01)。见表1。表1 不同浓度沙利度胺作用于SMMC 7721细胞的增殖抑制率比较
3 讨 论
原发性肝癌是世界卫生组织公布的十大恶性肿瘤之一，占世界癌症死亡原因的第3位，严重危害人类的健康。目前肝癌的治疗主要以手术切除为主，放疗、化疗、靶向治疗等方法效果不满意，这主要与肝癌侵袭转移的生物学特性有关。肝细胞癌是典型的多血管性肿瘤[1]，肝癌诱导新生血管生成的能力对于其生长、转移十分关键，因此寻找有效抑制血管生成的药物对于提高肝癌的疗效具有重要意义。
沙利度胺近年来作为血管生成抑制剂引起肿瘤学界关注，目前研究主要集中于其对血液系统肿瘤及部分实体瘤，包括骨髓瘤[2]、神经胶质瘤[3]、前列腺癌[4]、恶性黑色素瘤[5]等的作用，而有关沙利度胺治疗肝癌的研究报道较少。多项研究表明，其抗肿瘤机制可能与抑制肿瘤血管生成有关[6,7]。为探讨沙利度胺对肝癌细胞株SMMC 7721生长的影响，本文采用不同浓度的沙利度胺作用于SMMC 7721细胞株，应用MTT法测定吸光度值并计算细胞生长抑制率。结果显示，沙利度胺浓度从3.125 mg/L依次增至200.000 mg/L，其对肝癌细胞SMMC 7721的增殖抑制率从11.70%依次增至34.21%，当沙利度胺浓度达到25.0000 mg/L以上时，其对肝癌细胞株SMMC 7721的抑制作用与对照组比较差异有统计学意义。说明沙利度胺对体外SMMC 7721细胞株的增殖有抑制作用，且随着药物剂量的增加，细胞抑制作用逐渐增强。本文结果为沙利度胺的临床应用提供了依据。
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