对β胡萝卜素用于腹部放射损伤保护作用的研究 国家医学核心期刊目录
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研究表明，β 胡萝卜素作为抗氧化剂可以阻断氧化应激状态，促进过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢(H2O2)酶及谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH PX)的释放[1]，具有明显的延缓细胞和机体衰老及减少辐射对机体的损伤的功效[2,3];β 胡萝卜素还具有一定的抗突变作用，可抑制由于辐射引起的微核产生，对染色体畸变有一定的抑制作用;同时可延长接受辐射动物的存活时间，提高动物的存活率[4]。腹部放射治疗是腹部和盆腔恶性肿瘤治疗的有效手段之一，目前尚无有效的防护剂减轻腹部放射治疗损伤。国内外对于β 胡萝卜素抗辐射损伤的研究一般是以一次性全身照射为主[5]，对β 胡萝卜素用于腹部放射损伤保护作用的研究目前尚未见报道。本研究通过对大鼠补充一定剂量的β 胡萝卜素，观察其对腹部辐射损伤的保护作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 清洁级、健康成年雌性SD远交群大鼠40只，体质量207.5～217.0 g，平均(211.6±2.6) g。由北京维通利华实验动物有限公司提供(动物合格证号：SCXK京2007 0001)。用随机数字法分为4组：空白对照组(A组)、单纯照射组(B组)、β 胡萝卜素 5 mg/(kg·d)组(C组)、β 胡萝卜素 10 mg/(kg·d)组(D组)。每组10只大鼠，分笼喂养。
1.1.2 实验材料 β 胡萝卜素购自Sigma 公司;SOD、GSH PX、丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;正常熔点琼脂糖(MP)、低熔点琼脂糖(LMP)、RPMI 1640购自GibeoBRL公司;荧光剂DAPI购自Boehringer Mannheim公司;Tris购自Amresco公司;DPH购自美国Sigma公司;小牛血清购自Gibico公司;淋巴细胞分离液由爱普生物技术公司提供。
1.1.3 实验仪器 723型荧光分光光度计由日本岛津RF2540公司生产;3K30型低温离心机由德国Sigma公司生产; TCS SPZ荧光倒置共聚焦显微镜由Leica公司生产; Wlinac 23 EX直线加速器以及Portal Vision 实时影像系统由美国Varian公司生产。
1.2 方法
1.2.1 动物处理 照射前C组以β 胡萝卜素5 mg/(kg·d) 灌喂，D组以β 胡萝卜素10 mg/(kg·d) 灌喂，其他两组分别用等量花生油灌胃，各组均连续灌胃14 d，自由进食标准饲料。
1.2.2 动物模型的建立 照射前12 h禁食，称质量后用100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于手术板上，腹部给予X线单剂量9 Gy照射[6]。照射部位从剑突至肛门，照射面积9.9 cm×3.5 cm，放射源距腹壁距离(SSD)100 cm，组织补偿1 cm，剂量率300 cGy/ min，照射时间175 s，建立急性腹部放射性损伤模型[7]。
1.2.3 血样采集 照射后第4天将大鼠处死，腹主动脉取血4～6 mL，加入肝素抗凝管中，混匀，取30 μL血用于DNA损伤分析，其余3 000 r/min离心10 min，收集上层血浆于5 mL试管中，-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.4 SOD、GSH PX活性及MDA含量的测定SOD活性采用羟胺法测定，测定波长为550 nm。GSH PX活性采用DTNB直接法测定，测定波长412 nm。MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，测定波长532 nm。
1.2.5 DNA损伤的检测和分析 采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)[8]。DNA损伤分级：0度为无损伤;Ⅰ度为淋巴细胞核周围出现毛糙;Ⅱ度为淋巴细胞核轻度拖尾;Ⅲ度为淋巴细胞核中度拖尾;Ⅳ度为淋巴细胞核完全散开。
1.2.6 统计学处理 所有数据均采用SPSS 11.0及PPMS 1.5[9]统计软件进行处理，实验结果以±s表示,统计处理采用One Way ANOVA检验。
2 结 果
2.1 大鼠纳入实验的情况
B组1只大鼠在腹部照射后死亡，经尸体解剖发现其肠腔高度扩张，脆性增加，肠黏膜充血明显;C组1只大鼠在灌胃过程中死亡，经尸体解剖发现为气管 食管瘘;D组1只大鼠于采血过程中死亡，考虑为抽血引起循环血容量不足致死;其余37只大鼠完成实验。
2.2 血浆SOD、GSH PX活性及MDA浓度比较
与B组比较，C、D组大鼠血浆MDA含量明显下降(F=5.23,q=4.20、2.80，P<0.05);D组大鼠血浆GSH PX活性明显升高(F=3.70,q=5.11，P<0.05)
2.3 对DNA损伤的影响
0 μmol/L H2O2诱导淋巴细胞氧化损伤时，B组大鼠淋巴细胞DNA自发性损伤较其他3组严重(F=105.06,q=19.85～21.53,P<0.05)。分别用5、10和20 μmol/L H2O2诱导淋巴细胞氧化损伤时，B、C、D组淋巴细胞氧化损伤情况与A组比较差异均有显著性(F=383.92～582.56，q=36.25～47.68，P<0.05)。见表2。表1 各组大鼠SOD、GSH PX活性及MDA含量比较表2 各组大鼠以不同浓度H2O2诱导淋巴细胞氧化损伤情况比较
3 讨 论
腹部放射治疗是腹部恶性肿瘤常见的治疗方法之一，特别是对妇科肿瘤治疗有着较好的疗效。抗氧化是研究辐射损伤的重要方法。本研究的结果显示，各组大鼠血浆SOD浓度无显著性差异，C、D组的脂质过氧化代谢产物MDA的含量则低于B组，D组GSH PX的活性高于B组。提示β 胡萝卜素能够有效地提高机体内GSH PX的活性，降低由脂质过氧化反应生成的MDA的含量，减少脂质过氧化产物对机体的损害。SOD和GSH PX是机体内两种重要的抗氧化酶。其中SOD是一种金属酶，它对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基(O-2)，保护细胞免受损伤。在本实验中SOD无明显升高，可能局部的放射损伤不能有效激发机体的氧化应激反应所致。补充一定剂量的β 胡萝卜素可以抑制细胞膜上的不饱和脂肪酸产生的自由基链式反应，减少脂质过氧化物MDA生成;而GSH PX是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶。它特异性催化GSH PX对H2O2的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。β 胡萝卜素的补充有利于提高GSH PX的活性，亦可直接抑制和淬灭由电离辐射产生的活性单线态氧，维护线粒体膜的完整性，减轻由于放射线对人体产生的毒副作用。大量的研究证明，其具有抗氧化性，但并非剂量越高其抗氧化作用越强[4,10]。同时，摄入一定剂量的β 胡萝卜素有抗辐射及保护DNA作用[4]。
本文从DNA损伤结果可以看出，β 胡萝卜素对DNA损伤有一定的保护作用，但由于受辐射强度较大及H2O2浓度的影响，难以抵御更强的氧化损伤。β 胡萝卜素作为维生素A的前体，是体内重要的脂溶性抗氧化营养素，它可以保护细胞膜脂质免受过氧化损伤，其抗氧化作用基于分子中的多个共轭多烯双键的特殊结构，这种结构使其能与含氧自由基发生不可逆性反应，生成非常稳定的以碳为中心的自由基β 胡萝卜素[10]，从而清除生理性损伤产生的大量的自由基或活性氧(ROS)，如单线态氧、过氧化物等。氧自由基能与细胞膜的类脂质结合形成氧化脂质，导致细胞膜功能障碍，大量Ca2+进入细胞内，细胞内游离钙增加引起细胞死亡。同时细胞内外的一些活性氧，主要是氧自由基和H2O2，与细胞内大分子，如核酸、蛋白质、脂肪等共价结合，破坏细胞内成分，造成细胞死亡。
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研究表明，β 胡萝卜素作为抗氧化剂可以阻断氧化应激状态，促进过氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢(H2O2)酶及谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH PX)的释放[1]，具有明显的延缓细胞和机体衰老及减少辐射对机体的损伤的功效[2,3];β 胡萝卜素还具有一定的抗突变作用，可抑制由于辐射引起的微核产生，对染色体畸变有一定的抑制作用;同时可延长接受辐射动物的存活时间，提高动物的存活率[4]。腹部放射治疗是腹部和盆腔恶性肿瘤治疗的有效手段之一，目前尚无有效的防护剂减轻腹部放射治疗损伤。国内外对于β 胡萝卜素抗辐射损伤的研究一般是以一次性全身照射为主[5]，对β 胡萝卜素用于腹部放射损伤保护作用的研究目前尚未见报道。本研究通过对大鼠补充一定剂量的β 胡萝卜素，观察其对腹部辐射损伤的保护作用。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物及分组 清洁级、健康成年雌性SD远交群大鼠40只，体质量207.5～217.0 g，平均(211.6±2.6) g。由北京维通利华实验动物有限公司提供(动物合格证号：SCXK京2007 0001)。用随机数字法分为4组：空白对照组(A组)、单纯照射组(B组)、β 胡萝卜素 5 mg/(kg·d)组(C组)、β 胡萝卜素 10 mg/(kg·d)组(D组)。每组10只大鼠，分笼喂养。
1.1.2 实验材料 β 胡萝卜素购自Sigma 公司;SOD、GSH PX、丙二醛(MDA)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供;正常熔点琼脂糖(MP)、低熔点琼脂糖(LMP)、RPMI 1640购自GibeoBRL公司;荧光剂DAPI购自Boehringer Mannheim公司;Tris购自Amresco公司;DPH购自美国Sigma公司;小牛血清购自Gibico公司;淋巴细胞分离液由爱普生物技术公司提供。
1.1.3 实验仪器 723型荧光分光光度计由日本岛津RF2540公司生产;3K30型低温离心机由德国Sigma公司生产; TCS SPZ荧光倒置共聚焦显微镜由Leica公司生产; Wlinac 23 EX直线加速器以及Portal Vision 实时影像系统由美国Varian公司生产。
1.2 方法
1.2.1 动物处理 照射前C组以β 胡萝卜素5 mg/(kg·d) 灌喂，D组以β 胡萝卜素10 mg/(kg·d) 灌喂，其他两组分别用等量花生油灌胃，各组均连续灌胃14 d，自由进食标准饲料。
1.2.2 动物模型的建立 照射前12 h禁食，称质量后用100 g/L水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，固定于手术板上，腹部给予X线单剂量9 Gy照射[6]。照射部位从剑突至肛门，照射面积9.9 cm×3.5 cm，放射源距腹壁距离(SSD)100 cm，组织补偿1 cm，剂量率300 cGy/ min，照射时间175 s，建立急性腹部放射性损伤模型[7]。
1.2.3 血样采集 照射后第4天将大鼠处死，腹主动脉取血4～6 mL，加入肝素抗凝管中，混匀，取30 μL血用于DNA损伤分析，其余3 000 r/min离心10 min，收集上层血浆于5 mL试管中，-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.4 SOD、GSH PX活性及MDA含量的测定SOD活性采用羟胺法测定，测定波长为550 nm。GSH PX活性采用DTNB直接法测定，测定波长412 nm。MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，测定波长532 nm。
1.2.5 DNA损伤的检测和分析 采用单细胞凝胶电泳法(SCGE)[8]。DNA损伤分级：0度为无损伤;Ⅰ度为淋巴细胞核周围出现毛糙;Ⅱ度为淋巴细胞核轻度拖尾;Ⅲ度为淋巴细胞核中度拖尾;Ⅳ度为淋巴细胞核完全散开。
1.2.6 统计学处理 所有数据均采用SPSS 11.0及PPMS 1.5[9]统计软件进行处理，实验结果以±s表示,统计处理采用One Way ANOVA检验。
2 结 果
2.1 大鼠纳入实验的情况
B组1只大鼠在腹部照射后死亡，经尸体解剖发现其肠腔高度扩张，脆性增加，肠黏膜充血明显;C组1只大鼠在灌胃过程中死亡，经尸体解剖发现为气管 食管瘘;D组1只大鼠于采血过程中死亡，考虑为抽血引起循环血容量不足致死;其余37只大鼠完成实验。
2.2 血浆SOD、GSH PX活性及MDA浓度比较
与B组比较，C、D组大鼠血浆MDA含量明显下降(F=5.23,q=4.20、2.80，P<0.05);D组大鼠血浆GSH PX活性明显升高(F=3.70,q=5.11，P<0.05)
2.3 对DNA损伤的影响
0 μmol/L H2O2诱导淋巴细胞氧化损伤时，B组大鼠淋巴细胞DNA自发性损伤较其他3组严重(F=105.06,q=19.85～21.53,P<0.05)。分别用5、10和20 μmol/L H2O2诱导淋巴细胞氧化损伤时，B、C、D组淋巴细胞氧化损伤情况与A组比较差异均有显著性(F=383.92～582.56，q=36.25～47.68，P<0.05)。见表2。表1 各组大鼠SOD、GSH PX活性及MDA含量比较表2 各组大鼠以不同浓度H2O2诱导淋巴细胞氧化损伤情况比较
3 讨 论
腹部放射治疗是腹部恶性肿瘤常见的治疗方法之一，特别是对妇科肿瘤治疗有着较好的疗效。抗氧化是研究辐射损伤的重要方法。本研究的结果显示，各组大鼠血浆SOD浓度无显著性差异，C、D组的脂质过氧化代谢产物MDA的含量则低于B组，D组GSH PX的活性高于B组。提示β 胡萝卜素能够有效地提高机体内GSH PX的活性，降低由脂质过氧化反应生成的MDA的含量，减少脂质过氧化产物对机体的损害。SOD和GSH PX是机体内两种重要的抗氧化酶。其中SOD是一种金属酶，它对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基(O-2)，保护细胞免受损伤。在本实验中SOD无明显升高，可能局部的放射损伤不能有效激发机体的氧化应激反应所致。补充一定剂量的β 胡萝卜素可以抑制细胞膜上的不饱和脂肪酸产生的自由基链式反应，减少脂质过氧化物MDA生成;而GSH PX是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶。它特异性催化GSH PX对H2O2的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。β 胡萝卜素的补充有利于提高GSH PX的活性，亦可直接抑制和淬灭由电离辐射产生的活性单线态氧，维护线粒体膜的完整性，减轻由于放射线对人体产生的毒副作用。大量的研究证明，其具有抗氧化性，但并非剂量越高其抗氧化作用越强[4,10]。同时，摄入一定剂量的β 胡萝卜素有抗辐射及保护DNA作用[4]。
本文从DNA损伤结果可以看出，β 胡萝卜素对DNA损伤有一定的保护作用，但由于受辐射强度较大及H2O2浓度的影响，难以抵御更强的氧化损伤。β 胡萝卜素作为维生素A的前体，是体内重要的脂溶性抗氧化营养素，它可以保护细胞膜脂质免受过氧化损伤，其抗氧化作用基于分子中的多个共轭多烯双键的特殊结构，这种结构使其能与含氧自由基发生不可逆性反应，生成非常稳定的以碳为中心的自由基β 胡萝卜素[10]，从而清除生理性损伤产生的大量的自由基或活性氧(ROS)，如单线态氧、过氧化物等。氧自由基能与细胞膜的类脂质结合形成氧化脂质，导致细胞膜功能障碍，大量Ca2+进入细胞内，细胞内游离钙增加引起细胞死亡。同时细胞内外的一些活性氧，主要是氧自由基和H2O2，与细胞内大分子，如核酸、蛋白质、脂肪等共价结合，破坏细胞内成分，造成细胞死亡。
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